سمية الخلايا التي يتوسط فيها على الجسم المضاد

مستقبل Fc ودراسات C1q: يمكن التخلص من إمكانية سمية الخلايا التي يتوسط فيها على الجسم المضاد (ADCC) وسمية الخلايا معتمدة على المتمم (CDC) بواسطة تعقيد الجسم المضاد إلى أي هدف مفرط التعبير على أغشية الخلية بواسطة طفرات نطاق المفصلة (على سبيل المثال، L234A، وL235A). هذه الأحماض الأمينية المستبدلة، الموجودة في نطاق المفصلة IgG1 لـ mAb، يكون من المتوقع أن ينتج عنها ربط أضعف لـ mAb بمستقبلات Fc بشرية (وليس FcRn)، نظرا للاعتقاد في حدوث ربط FcgR داخل المواقع المتداخلة على نطاق المفصلة IgG1. يمكن أن تؤدي سمة mAb إلى خواص سلامة محسّنة على الأجسام المضادة المحتوية على نوع بري من IgG. ربط mAb بمستقبلات Fc بشرية يمكن أن يتحدد بواسطة تجارب عد كريات التدفق باستخدام خطوط خلية (مثلا، THP-1، وK562) وخط خلية CHO مُهندّس يعبر عن FcgRIIb (أو FcgRs أخرى). مقارنة بالأجسام المضادة وحيد النسيلة المقارنة لـ IgG1، يظهر mAb ربط أقل بـ FcgRI وFcgRIIa بينما لا يتأثر الربط بـ FcgRIIb. ربط وتنشيط C1q بواسطة معقدات مولد ضد /IgG مناعي يحُدث تتابع المتمم التقليدي مع الاستجابات الالتهابية و / أو التنظيم المناعي التالية. تم تحديد وضع موقع ربط C1q على IgGs إلى البقايا داخل نطاق مفصلة IgG. تم تقييم ربط C1q للتركيزات المتزايدة لـ mAb بواسطة C1q ELISA. أوضحت النتائج عدم قدرة mAb على الارتباط بـ C1q، كما هو متوقع عند المقارنة بـ ربط العينة المنقارنة للنوع البري لـ IgG1. بشكل عام، يبطل تطفير نطاق المفصلة L234A، L235A ربط mAb بـ FcgRI، وFcgRIIa وC1q لكنه لا يؤثر على تفاعل mAb مع FcgRIIb. تقترح هذه البيانات أنه في الكائن الحي، يتفاعل mAb ذا Fc المطفر على نحو طبيعي مع FcgRIIb المثبط ولكنه على الأرجح يفشل في التفاعل مع مستقبلات FcgRI وFcgRIIa النشطة أو C1q.

ربط FcRn البشري: مستقبل (FcRn) حديث التكوين يكون مسئولا عن نقل IgG عبر المشيمة والتحكم في عمر النصف تقويضي لجزيئات IgG. قد يكون من المرغوب زيادة طرف عمر النصف لجسم مضاد وذلك لتحسين الفعالية، لتقليل الجرعة أو تكرار الإعطاء، أو لتحسين تحدي وضع الهدف. على نحو بديل، يمكن أن يكون من المفيد القيام بعكس ما سبق أي، تقليل طرف عمر النصف لجسم مضاد لتقليل تعرض الجسم كله أو لتحسين نسب ربط هدف-بغير الهدف. إن ضبط التفاعل بين IgG ومستقبل الإنقاذ الخاص به FcRn، يقدم طريقة لزيادة أو تقليص طرف عمر النصف لـ IgG. بروتينات في التدوير، التي تشتمل على IgG، تكون مأخوذة في طور المائع خلال الاحتساء المكروي بواسطة خلايا معينة، مثل تلك الخاصة بالبطائن الوعائية. IgG يمكنه ربط FcRn بجسيمات داخلية في ظل ظروف حمضية قليلا (رقم هيدروجيني يتراوح من 6.0–6.5) ويمكنه تدوير إلى سطح الخلية، حيث يتم إطلاقه في ظل ظروف محايدة تقريبا (الرقم الهيدروجيني يتراوح من 7.0–7.4). تخطيط موقع ربط نطاق Fc على FcRn80، 16، 17أوضح أن اثنين من بقايا هيستيدين التي يتم عكسها عبر الفصائل، His310 وHis435، تكون مسئولة عن اعتماد هذا التفاعل على الرقم الهيدروجيني. باستخدام تقنية عرض الملتهمة، تم تعريف تطفير نطاق Fc فأر الذي يزيد من الارتباط بـ FcRn ويمد عمر النصف لفأر IgG (انظر Victor، G. et al.; Nature Biotechnology (1997)، 15(7)، 637-640). قد تم أيضاً تحديد طفرات منطقة Fc التي تزيد من ألفة الارتباط الخاصة بـ IgG البشرية وذلك لـ، FcRn عند رقم هيدروجيني 6.0 ولكن ليس عند الرقم الهيدروجيني 7.4 (انظر Dall'Acqua William F، et al.، Journal of Immunology (2002)، 169(9)، 5171-80). علاوة على ذلك وفي إحدى الحالات، تمت ملاحظة زيادة مشابهة في الارتباط بالاعتماد على الرقم الهيدروجيني (حتى 27 ضعفاً) وذلك لـ FcRn من القرود الهندية وينتج عن ذلك زيادة بمقدار الضعف في فترة نصف العمر الخاصة من القرود الهندية مقارنة بـ IgGالأساسية (انظر Hinton، Paul R. et al.، Journal of Biological Chemistry (2004)، 279(8)، 6213-6216). أوضحت تلك الاكتشافات أنه من الممكن أن يتم مد فترة نصف العمل الخاصة ببلازما الجسم المضاد العلاجي عن طريق تهيئة التفاعل بين منطقة Fc مع FcRn. وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تقلل طفرات منطقة Fc التي توهن التفاعل مع FcRn من فترة نصف العمر للجسم.

ب 10. الحركيات الدوائية

لكي يتم توليد جزيء DVD-Ig به خصائص حركيات دوائية مطلوبة، فيتم في أحد النماذج اختيار mAbs أساسي. يتمثل أحد الاعتبارات في الاستجابة المولدة للمناعة للأجسام المضادة أحادية النسيلة ( أي HAHA، استجابة الجسم المضاد البشر والجسم المضاد للبشر، HACA، استجابة الجسم المضاد الخيمري البشري) والتي تعمل أيضاً على تعقيد الحركيات الصيدلانية الخاصة بالعوامل العلاجية المذكورة. في أحد النماذج، يتم استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة مع أقل نسبة من توليد المناعة أو عدم وجود توليد مناعة وذلك لتركيب جزيئات DVD-Ig بحيث تكون جزيئات DVD- Igs الناتجة تكون بها أقل قدر من توليد المناعة أو لا يوجد بها توليد مناعة على الإطلاق. تشتمل بعض العوامل المذكورة التي تحدد PK من mAb على، ليس على بسبيل الحصر، الخصائص الأساسية لـ mAb (متوالية الحمض الأميني VH ) وتوليد المناعة؛ ووظائف ربط FcRn ووظائف Fc.

يمكن بسهولة تحديد خصائص PK الخاصة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة الأساسية التي تم اختيارها من القوارض مثل خصائص PK الخاص بالقوارض نفسها والتي تكون مطابقة بشكل جيد (أو قريبة)لخصائص PK من خصائص PK من الأجسام المضادة أحادية النسيلة في قرد الرباح وفي البشر. يتم تحديد خصائص PK كنا تم وصفف ذلك في الجزء 1-2-2-3-أ.

وبعد انتقاء الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي لها خصائص PK مطلوبة (وخصائص أخرى مطلوبة كما تم وصف ذلك في هذه الوثيقة) يتم الحصول على DVD-Ig. وحيث أن جزيئات DVD-Ig تشتمل على اثنين من نطاقات ربط مولد الضد فإن اثنين من الأجسام المضادة أحادية النسيلة وخصائص PK لـ DVD-Ig يتم اختبارها أيضاً. وبالتالي، وأثناء تحديد خصائص PK لـ DVD-Ig، يمكن استخدام اختبارات PK التي تحدد خصائص PK بالاعتماد الفعالية الخاصة بكل من نطاقات ربط مولد الضد التي تم اشتقاقها من اثنين من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الأساسية. يمكن تحديد خصائص PK لـ DVD-Ig كما تم وصف ذلك في المثال رقم 1-2-2-3أ. تشتمل العوامل الإضافية التي يمكن أن تؤثر على خصائص PK من DVD-Ig على اتجاه نطاق ربط مولد الضد (CDR) وحجم الرابط وتفاعلات Fc / FcRn. يمكن أن يتم تقييم الأجسام المضادة الأساسية عن طريق اختبار المتغيرات التالية: الامتصاص والتوزيع والأيض والإفراز.

الامتصاص: وحتى الوقت الحاضر يتم إعطاء الأجسام المضادة أحادية النسيلة العلاجية من خلال المسارات عن غير طريق القناة الهضمية (على سبيل المثال، داخل الأوردة [IV] أو تحت الجلد [SC] أو داخل العضلات [IM]). يتم امتصاص mAb بداخل الجهاز الدوري إما من خلال الإعطاء عن طريق SC أو IM، وذلك من خلال الفراغ بداخل الأمعاء الدقيقة ويتم هذا الإعطاء بشكل أساسي من خلال المسار اللمفاوي. يمكن أن تنتج قابلية التشبع أو التحلل المجموعي أو تحلل البروتين عن العديد من أنواع الإتاحة الحيوية وذلك بعد عملية الإعطاء خارج الأوعية. وعادةً يمكن ملاحظة الزيادات في الإتاحة الحيوية المطلقة باستخدام جرعات متزايدة من الأجسام المضادة أحادية النسيلة وذلك نتيجة القدرة على التشبع أو التحلل البروتيني عند الجرعات العالية. تكون عملية الامتصاص الخاصة بـ mAbبطيئة مثل ارتشاحات المائع اللمفاوية وذلك ببطء بداخل النظام الوعائي، وذلك أثناء عملية الامتصاص التي يمكن أن تحدث على مدى ساعة وذلك في العديد من الأيام. تكون الإتاحة الحيوية المطلقة من الأجسام المضادة أحادية النسيلة التالية وذلك بعد الإعطاء SC والتي تكون في شكل عام في مدى من 50% إلى 100%.

التوزيع: وبعد إعطاء عن طريق IV تتبع الأجسام المضادة أحادية النسيلة عادةً تركيز المصل ثنائي الطور (أو البلازما)- منحنى الزمن، وذلك بدءاً من طور التوزيع السريع، ويلي ذلك بدء الإنتزاع السريع. وبصفة عامة يقوم نموذج الحركيات الصيدلانية الأساسي بوصف هذا النوع من منحنى الحركيات الصيدلانية. يكون حجم التوزيع في الحجيرة المركزية (Vc) والخاصة بـ mAb مساوياً أو أعلى بشكل قليل من حجم البلازما (2-3 لتر). يكون النمط ثنائي الطور في تركيز المصل (البلازما) مقابلاً لمنحنى الزمن والذي يمكن أن لا يكون واضحاً في مسارات الإعطاء عن غير القناة الهضمية الأخرى مثل IM أو SC وذلك بسبب أن طور توزيع البلازما الخاص بمنحنى تركيز مصل (البلازما)-الزمن يتم حجبه عن طريق جزء الإعطاء الطويل. تشتمل العديد من العوامل بما في ذلك الخصائص الفيزيائية الكيميائية والموضع الأساسي والامتصاص الذي يتوسطه اتجاه المستهدف والقدرة على الارتباط الخاصة بالنسيج، ولا تؤثر جرعة mAb  على التوزيع الحيوي لـ mAb. يمكن أن تسهم بعض تلك العوامل في التوزيع الحيوي غير الطولي الخاص بـ mAb.

الأيض والإفراز: ونتيجة للحجم الجزيئي، فإن الأجسام المضادة أحادية النسيلة لا يتم إفرازها في البول من خلال الكلية. ويتم تثبيت تلك الأجسام بشكل أساسي عن طريق الأيض ( على سبيل المثال عمليات الهدم في الخلايا). وبالنسبة للأجسام المضادة العلاجية المعتمدة على IgG  فإن أمداء فترة نصف العمر تتراوح من ساعات إلى يوم أو يومين وحتى 20 يوماً. يمكن أن يؤثر التخلص من mAb في العديد من العوامل، بما في ذلك ولكن ليس على سبيل الحصر، الألفة الخاصة بمستقبل FcRn وتوليد المناعة الخاص بـ mAb ودرجة المعالجة بالجلوكوزيل لـ mAb وقابلية mAb للتحلل والأنتزاع الذي يتوسطه المستقبل

ب-11 نمط التفاعل التبادلي للنسيج على الأنواع السامة والبشرية:

يقترح نمط التلطيخ النموذجي أن السمية البشرية المحتملة يمكن تقييمها في سلالات tox، وتكون سلالات tox بارة عن تلك الحيوانات التي تمت دراسة عدم ارتباطها بالسمية.

يتم اختيار الأجسام المضادة الفردية لكي تفي باثنين من المعايير. (1) تلطيخ النسيج المناسب للتعبير المعروف عن الجسم المضاد المستهدف. (2) نمط التشبع المشابه بين الأنواع البشرية والأنواع السامة من الأنسجة من نفس العضو.

المعيار الأول: تستخدم أنواع الانتقاء الخاصة بالتحصين و/أو انتقاء الجسم المضاد إعادة الارتباط بشكل نمطي أو مولدات الضد التخليقية (البروتينات أو الكربوهيدرات أو أي جزيئات أخرى). وبالارتباط بمولد الضد العكسي الطبيعي أو ناتج التصفية العكسي فيما يخص مولدات الضد يعتبر جزءاً من العملية الخاصة بقمع التصفية الخاص بالأجسام المضادة العلاجية. وبالرغم من ذلك، فإن تصفية العديد من الأجسام المضادة تتم على نحو غير تجريبي. وبالتالي، يتم استخدام دراسات التفاعل التبادلية للأنسجة مع الأنسجة البشرية من كل الأعضاء الرئيسية لكي يتم التحكم في الارتباط غير المرغوب من الجسم المضاد أو أي مولد ضد غير مرتبط آخر.

المعيار الثاني: تم اختبار دراسات التفاعلية التبادلية للأنسجة المقارنة باستخدام أنسجة الأنواع البشرية والسامة (من قرد الرباح والكلاب، ويمكن القوارض وحيوانات أخرى، لها نفس الأنسجة والتي تكون 36 أو 37 نسيجاً يتم اختبارها في العديد من الدراسات البشرية ) وذلك لكي تتم المساعدة في إجراء انتقاء للأنواع السامة. في العديد من دراسات التفاعلية التبادلية الخاصة بالأنسجة وذلك على أجزاء الأنسجة التي تم تجميدها وذلك لأغراض علاجية، تم توضيح الارتباط غير المُتوقع لمولد الضد المعروف و/أو وبدرجة ارتباط أقل بالأنسجة وذلك بالاعتماد على أي مستوي من التفاعلات (الارتباط غير المحدد، والارتباط ذي المستوي الأقل أو مولدات الضد المشابهة أو المستوي المنخفض من الشحنة بالاعتماد على التفاعلات، إلخ). في أي حالة فإن أنواع الحيوانات عالية السمية تكون هي النوع ذي الدرجة الأعلى في الارتباط بالنسيج البشري أو النسيج الحيواني.      

جاءت دراسات التفاعل التبادلية الخاصة بالأنسجة بعد الدراسات التوجيهية المنتظمة والتي تشتمل على EC CPMP Guideline III/5271/94 “Production and quality control of mAbs” and the 1997 US FDA/CBER “Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use. تم تجميد أجزاء (5 ميكرو متر) من الأنسجة التي تم الحصول عليها عن طريق الصِّفَة التَّشْريحِيَّة أو الخزعة والتي يتم تثبيتها وتجفيفها على غرض زجاجي. تم إجراء تلطيخ أجزاء النسيج بإنزيم بيروكسيداز باستخدام نظام أفيدين-بيوتين. FDA’s Guidance “Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use”. Relevant references include Clarke J 2004، Boon L. 2002a، Boon L 2002b، Ryan A 1999.

 يتم في الغالب إجراء دراسات التفاعل التبادلية الخاصة بالأنسجة في مرحلتين، تشتمل المرحلة الأولى على تبريد أجزاء 32 نسيج (تكون بشكل نمطي عبارة عن الغدة الأدرينالية والقناة المعدية المعوية والبروستاتا والمثانة والقلب والجهاز العضلي وخلايا الدم والكلية والجلد والنخاع العظمي والكبد والحبل الشوكي والثدي والرئة والطحال والمخيخ والعقد اللمفية والخصيتين وقشرة المخ والمبيض والغدد الصماء والقولون والبنكرياس والغدة الدرقية والأغشية البطانية والغدة جار الدرقية والحالب والعين والغدة النخامية والرحم وأنبوب فالوب والمشيمة) وذلك من مانح من أحد البشر. في الطور الثاني تم إجراء دراسة التفاعل العرضي باستخدام ما يصل إلى 38 نسيج (بما في ذلك: الغدة الإدرينالية، الدم، الأوعية الدموية، ونخاع العظام، والمخيخ، المخ، وعنق الرحم والمريء والعين والقلب والكلى والأمعاء الكبيرة والكبد والرئة والعقد الليمفاوية، الغدة الثديية للثدي، المبيض، قناة البيض، والبنكرياس، والغدة المجاروة للدرقية، الأعصاب الطرفية، والغدة النخامية، والمشيمة، والبروستاتا، والغدة اللعابية والجلد والأمعاء الدقيقة والحبل الشوكي والطحال والمعدة و هيكل العضلات، والخصية والغدة التيموسية والغدة الدرقية واللوزتان والحالب والمثانة البولية والرحم ) وذلك من ثلاثة من البالغين غير أقارب. تم إجراء الدراسات بشكل نمطي عند مستوي جرعتين على الأقل.

يمكن معالجة الجسم المضاد العلاجي (أي جسيم الاختبار) والنمط النظير المطابق للجسم المضاد الخاص بعينة الاختبار بالبيوتنييل وذلك لاكتشاف معقد أفيدين –بيوتين (ABC)؛ ويمكن استخدام طرق استكشاف أخرى والتي يمكن أن تشتمل على اكتشاف جسيم مرقم خاص بالجسم المضاد الثلاثي بالنسبة لـ FITC (أو أي جسم آخر) أو التعقيد المسبق باستخدام المرقم البشري المضاد لـ IgG وذلك بالنسبة لجسيم الاختبار غير المرقم.

وعلى نحو مختصر، يتم تثبيت الأجزاء المجمدة (حوالي 5 ميكرو متر) من الأنسجة البشرية التي تم الحصول عليها عند التشريح أو التقطيع ويتم تجفيفها على غرض زجاجي. تم إجراء تلطيخ أجزاء النسيج بإنزيم بيروكسيداز باستخدام نظام أفيدين-بيوتين. أولاً (في حالة التعقيد المسبق ونظام الاكتشاف) يتم احتضان جسيم الاختبار باستخدام الجسم المضاد البشري IgG    الذي تمت معالجته بالبيوتينيل وتم تطويره بحيث يكون معقد مناعي. تتم إضافة المعقد المناعي عند التركيزات النهائية بحوالي 2 10 ميكرو جرام/مل من جسم الاختبار على مفرزات النسيج وذلك على غرض زجاجي ويتم بعد ذلك تفاعل أجزاء النسيج لمدة 30 دقيقة باستخدام طقم أفيدين-بيوتين بيروكسيداز. ونتيجة لذلك، تم استخدام DAB (3، 3'- داي إيمينوبنزيدين) وركيزة تحتية خاصة بتفاعل بيروكسيميداز لتلطيخ النسيج. تم استخدام خرزات سيفاروز-مولد الضد كجزاء نسيج لعينة موجبة.

يتم الحكم على أي تلطيخ خاص بحيث يكون متوقعاً (على سبيل المثال، يكون متوائماً مع التعبير عن مولد الضد) أو غير متوقع وذلك في تفاعله بالاعتماد على التعبير المعروف لمولد الضد المستهدف محل الاهتمام. يتم إحراز تلطيخ تم التحكم فيه وذلك من أجل الشدة والتكرار. يمكن أن تساعد دراسات التنافس للمصل أو لمولد الضد أو الإعاقة في تحديد ما إذا كان التلطيخ الذي تمت ملاحظته محدداً أو غير محدد.

إذا تم اكتشاف اثنين أن اثنين من الأجسام المضادة المختارة تفي بمبادئ الانتقاء الخاص بتلطيخ النسيج المناسب فإن التلطيخ المتوافق بين البشر والحيوانات غير السامة يمك أن يتم اختياره لتوليد DVD-Ig.

يجب أن يتم فصل دراسة التفاعلية التبادلية الخاصة بالنسيج باستخدام بنية DVD-Ig النهائية، ولكن عندما تسلك تلك الدراسات نفس البروتوكول الذي تم تلخيصه في هذه الوثيقة، فإنها تكون دراسات أكثر تعقيداً لكي تقوم بتقييم أي ارتباط من أي من اثنين من الأجسام المضادة الأساسية ويمكن أن تكون هناك حاجة لتأكيد أي ارتباط لم يتم توضيحه باستخدام دراسات التنافس لمركب الضد المعقد.

من الواضح بشكل كبير أن المعقد الذي تم الحصول عليه من دراسات التفاعل التبادلي مع الجزيء متعدد النوعية مثل DVD-Ig قد تم تلخيصه بشكل كبير وذلك إذا تم اختيار اثنين من الأجسام المضادة الأساسية لـ(1) افتقارها لاكتشافات التفاعل التبادلي الخاصة بالنسيج و (2) المشابهة المناسبة للنسيج من خلال اكتشافات التفاعل التبادلي الخاصة بالأنسجة البشرية المشابهة.

ب-12 الخصائص العامة والانتقائية

لكي يتم توليد جزيء DVD-Ig مع الخصائص الخاصة به والانتقائية الخاصة به فإن هناك حاجة لاختيار mAbs الأساسي مع خصائص بديلة وشكل انتقائية بديل.

يمكن أن تكون دراسات الارتباط وخصائص الانتقائية مع DVD-Ig معقدة نتيجة وجود أربعة مواضع للربط أو أكثر اثنين كل مولد ضد. وعلى نحو مختصر، هناك حاجة لاستخدام دراسات الارتباط باستخدام ELISA، BIAcore و KinExA  أو أي دراسات تفاعل أخرى مع DVD-Ig  لمراقبة ارتباط واحد أو أكث رمن مولدات الضد مع جزيء DVD-Ig. وعلى الرغم من أن تقنية BIAcore يمكن أن تحقق الارتباط التتابعي وغير المستقل لمولدات الضد المتعددة، فإن طرق تقليدية أخرى بما في ذلك ELISA أو تقنيات أكثر تقدما مثل KinExA لا تستطيع ذلك. وبالتالي، تكون الخصائص المحددة للجسم المضاد أكثر أهمية. وبعد أن يتم تحديد خصائص معينة للجسم المضاد وذلك مثل خاصية الاحتجاز الخاصة بمواضع الربط الفردية، فيتم تحديد تلك الخصائص لجزيء DVD-Ig بشكل أكثر اختصاراً.

سوف يكون من الواضح أن المعقد الخاص بتحديد نوعية DVD-Ig أكثر اختصاراً إذا تم انتقاء الأجسام المضادة الأساسية قبل أن يتم تجميعها بداخل DVD-Ig.

يمكن أن تأخذ دراسات التفاعل الخاصة بمولد الضد-الجسم المضاد العديد من الصور بما في ذلك العديد من الصور الكلاسيكية الخاصة بدراسات التفاعل بين البروتينات، بما في ذلك ELISA  (اختبار الامتصاص المناعي المرتبط بالانزيم) واختبار الفصل الطيفي للكتلية، والارتباط التبادلي الكيميائي، و SEC مع التشتت الخفيف والتعبير عن التعادل ونفاذية الجل والترشيح الفائق، والفصل الكروماتوجرافي وتحليل SEC الخاص بالمناطق الكبيرة و الطرق المركزي الفائق للمستحضرات الدقيقة (التعادل عن طريق الترسيب) وطرق القياس الطيفي والقياس العياري الدقيق والتعادل على طريق الترسيب (في الطرد المركزي التحليلي الفائق) وسرعة الترسيب (في الطرد المركزي التحليلي) ورنين البلازمون المغناطيسي (بما في ذلك BIAcore). تشتمل المراجع ذات الصلة على " Current Protocols in Protein Science”، John E. Coligan، Ben M. Dunn، David W. Speicher، Paul T، Wingfield (eds.) Volume 3، chapters 19 and 20، published by John Wiley & Sons Inc " والمراجع المذكورة فيها و " Current Protocols in Immunology”، John E. Coligan، Barbara E. Bierer، David H. Margulies، Ethan M. Shevach، Warren Strober (eds.) published by John Wiley & Sons Inc " والمراجع ذات الصلة المذكورة بها.

إطلاق السيتوكين في الدم بكامله: يمكن فحص تفاعل mAb مع خلايا الدم البشرية عن طريق اختبار إطلاق السيتوكين (Wing، M. G. Therapeutic Immunology (1995)، 2(4)، 183-190; “Current Protocols in Pharmacology”، S.J. Enna، Michael Williams، John W. Ferkany، Terry Kenakin، Paul Moser، (eds.) published by John Wiley & Sons Inc; Madhusudan، S. Clinical Cancer Research (2004)، 10(19)، 6528-6534; Cox، J. Methods (2006)، 38(4)، 274-282; Choi، I. European Journal of Immunology (2001)، 31(1)، 94-106). وعلى نحو مختصر تم تضمين العديد من تركيزات mAb  في الدم البشري بكامله لمدة 24 ساعة. يغطي التركيز الذي تم اختباره على مدى واسع بما في ذلك التركيز النهائي الذي يشبه مسويات الدم النمطية في المرضى (100 نانو جرام/مل-100 ميكرو جرام/مل). وبعد احتضان المواد الخافضة للتوتر السطحي ونواتج تحلل الخلية يتم تحليل تلك المواد لاستكشاف وجود IL-1Rα، TNF-α، IL-1b، IL-6، IL-8. تمت مقارنة تركيز منحنيات السيتوكين لتوليد mAb بالمقارنة بالمنحنيات التي يتم إنتاجها عن طريق عينة المقارنة IgG البشرية السلبية وعينة المقارنة LPS أو PHA. يتم عرض منحنيات السيتوكين عن طريق mAb من كل من المواد الخافضة للتوتر السطح للخلية ونواتج تحلل الخلية بالمقارنة بعينة المارنة البشرية من IgG. في أحد النماذج، لا يتفاعل الجسم المضاد أحادي النسيلة مع خلايا الدم البشرية لكي يتم على نحو تلقائي إطلاق السيتوكينات الالتهابية.

تكون دراسات إطلاق السيتوكين الخاصة بـ DVD-Ig معقدة وذلك نتيجة لأربعة أو أكثر من مواضع الربط اثنين كلك مولد ضد. وعلى نحو مختصر، تقوم دراسات إطلاق السيتوكين، كما تم وصف ذلك في هذه الوثيقة بقياس تأثير جزيء DVD-Ig الكلي على كل أنظمة الدم أو أنظمة الخلية الأخرى، ولكنها يمكن أن تحدد أي جزء من الجزيء يتسبب في إطلاق السيتوكين. وبمجرد أن يتم اكتشاف إطلاق السيتوكين، يتم التأكد من نقاء مستحضر DVD-Ig وذلك بسبب بعض المكونات الخلوية المشاركة في التنقية والتي يمكن أن تتسبب بنفسها في إطلاق السيتوكين. وإذا لم يكن من المقصود تحقيق النقاء، فيكون هناك حاجة لتشظي DVD-Ig (على سبيل المثال لا الحصر إزالة جزء Fc وفصل مواضع الربط إلخ) وتطفير موضع الربط أو أي طرق أخرى وذلك لكي يتم تأكيد أية ملاحظات. وبالتالي فمن الواضع أن هذا المعقد بسيط جداً إذا تم اكتشاف أن اثنين من الأجسام المضادة الأساسية قد تم اختيارها وذلك لنقص إطلاق السيتوكين قبل أن يتم دمجه مع DVD-Ig.

ب-13 التفاعلية التبادلية لأنواع أخرى فيما يتعلق بالدراسات المتعلقة بالسمية:

في أحد النماذج، يتم اختيار الأجسام المضادة الفردية التي لها قدرة على التفاعل التبادلي الكافية وذلك في الأنواع الخاصة بالسمية المناسبة، على سبيل المثال قرد الرباح. تحتاج الأجسام المضادة أن ترتبط مع مستهدفات من أنوع متشابهة عند الموضع أورثو (أي قرد الرباح) والذي يظهر استجابة مناسبة (تعديل، حياد أو تنشيط). في أحد النماذج، يجب أن تكون التفاعلية التبادلية (الألفة/الألفة) لأنواع عند الموضع أورثو في مدى حوالي 10 أضعاف من المستهدف البشري. وفي الممارسة التجريبية، يتم تقييم الأجسام المضادة الأساسية للعديد من الأنواع بما في ذلك الفئران والجرذان والقرود (والأنواع الرئيسية غير البشرية الأخرى)، وأيضاً أنواع النموذج الخاص بالمرض (أي الأغنام الخاصة بنموذج الربو). تسمح دراسات التفاعل التبادلي للأنواع السامة من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الأساسية والتي تسمح بالدراسة المتعلقة بالسمية في المستقل والخاصة بـ DVD-Ig-Ig في نفس الأنواع. ولهذا السبب، يجب أن يكون لاثنين من الأجسام المضادة أحادية النسيلة تفاعلية تبادلية مقبولة للأنواع السامة المعروفة وبالتالي السماح بإجراء دراسات السمية لـ DVD-Ig في نفس الأنواع.

يمكن اختيار mAbs الأصلي من مجموعة متنوعة من mAbs القادرة على ربط مستهدفات معينة معروفة في المجال. تشتمل تلك المجموعات، ولكن ليس على سبيل الحصر على الجسم المضاد لـ TNF (البراءة الأمريكية رقم 6،258،562)، -IL-12 و/أو الجسم المضاد -IL-12p40 (البراءة الأمريكية رقم 6،914،128) والجسم المضاد IL-18 (البراءة الأمريكية 2005/0147610 A1) ومضاد- C5،  مضاد- CBL،  مضاد- CD147،  مضاد- gp120،  مضاد- VLA-4،  مضاد- CD11a،  مضاد- CD18،  مضاد- VEGF،  مضاد- CD40L، مضاد CD-40.، (على سبيل المثال، انظر الطلب الدولي رقم WO2007124299) مضاد- Id،  مضاد- ICAM-1،  مضاد- CXCL13، مضاد- CD2،  مضاد- EGFR،  مضاد- TGF-بيتا 2،  مضاد- HGF،  مضاد- cMet، مضاد DLL-4،  مضاد- NPR1،  مضاد- PLGF،  مضاد- ErbB3،  مضاد- E-سيلكتين،  مضاد- Fact VII،  مضاد- Her2/neu،  مضاد- F gp،  مضاد- CD11/18،  مضاد- CD14،  مضاد- ICAM-3،  مضاد- RON، مضاد CD-19،  مضاد- CD80 ( على سبيل المثال.، انظر الطلب الدولي WO2003039486،  مضاد- CD4،  مضاد- CD3،  مضاد- CD23،  مضاد- بيتا 2-إنتجرن،  مضاد- ألفا4 بيتا 7،  مضاد- CD52،  مضاد- HLA DR،  مضاد- CD22 ( على سبيل المثال انظر البراءة الأمريكية رقم 5،789،554) مضاد- CD20،  مضاد- MIF،  مضاد- CD64 (FcR)،  مضاد- TCR ألفا بيتا،  مضاد- CD2، مضاد- Hep B،  مضاد- CA 125،  مضاد- EpCAM،  مضاد- gp120،  مضاد- CMV،  مضاد- gpIIbIIIa،  مضاد- IgE،  مضاد- CD25،  مضاد- CD33،  مضاد- HLA، مضاد- IGF1، 2، مضاد IGFR،  مضاد- VNR إنتجرن،  مضاد- IL—ألفا 1،  مضاد- IL- بيتا،  مضاد- مستقبل IL-1،  مضاد- IL-2 مستقبل،  مضاد- IL-4،  مضاد- مستقبلIL-4،  مضاد- IL5،  مضاد- مستقبل IL-5،  مضاد- IL-6R، مضاد RANKL، NGF، DKK، ألفا مضاد بيتا 3، IL-17A، مضاد- IL-8،  مضاد- IL-9،  مضاد- IL-13،  مضاد- مستقبل IL-13 مضاد، IL-17، مضاد IL-23، مضاد IL-23p19 (انظر LG. 2005 Selection، design، and engineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol. 116:731-6 and http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodies.html).

 يمكن اختيار mAbs الأساسي أيضاً من مجموعة من الأجسام المضادة العلاجية المتنوعة والتي تم التصديق على استخدامها في التجارب الإكلنيكية أو في تطوير الاستخدام الإكلينيكي. تشتمل الأجسام المضادة العلاجية المذكورة على، ليس على سبيل الحصر، ريتزوماب (Rituxan®، IDEC/Genentech/Roche) (انظر على سبيل المثال البراءة الأمريكية رقم5،736،137 ) والجسم المضاد الخيمري CD20 الذي تم التصديق عليه لمعالجة مرض الورم اللمفاوي خلاف ورم Hodgkin's ؛ HuMax-CD20 ؛ ومضاد CD20 الذي تم تطويره حالياً عن طريق Genmab و الجسم المضاد لـ CD20، تم وصفه في البراءة الأمريكية رقم 5، 500،362، AME-133 (Applied Molecular Evolution)، hA20 (Immunomedics، Inc.)، HumaLYM (Intracel)، and PRO70769 (PCT/US2003/040426، entitled "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof") وتراستوزوماب (Herceptin®، Genentech) (انظر، على سبيل المثال البراءة الأمريكية رقم 5،677،171) والجسم المضاد المعد للاستخدام البشري Her2/neu الذي تم التصديق عليه لمعالجة سرطان الثدي؛ وبيرتوزوماب (rhuMab-2C4، Omnitarg®)، تم تطويره حالياً عن طريق Genentech والجسم المضاد Her2 تم وصفه في البراءة الأمريكية رقم 4،753،894 وسيتزوماب (Erbitux®، Imclone) ( البراءة الأمريكية رقم 4،943،533 و PCT الخاصة بالطلب الدولي رقم WO 96/40210) والجسم المضاد الخيمري المضاد لـ EGFR وذلك في العديد من التجارب الإكلينيكية في معالجة السرطانات؛ ABX-EGF (البراءة الأمريكية رقم 6،235،883) والذي تم تطويره حالياً عن طريق Abgenix-Immunex-Amgen، HuMax- EGFr (U.S. Ser. No. 10/172،317) والذي تم تطويره حالياً عن طريق Genmab ؛،425، EMD55900، EMD62000 و EMD72000 (Merck KGaA) (البراءة الأمريكية رقم 5،558،864 ؛ Murthy et al. 1987، Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al.، 1987، J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al.، 1991، Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al.، 1993، J. Cell Biophys. 1993، 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al.، 1993، Br J Cancer. 1993، 67(2):247-53; Modjtahedi et al، 1996، Br J Cancer، 73(2):228-35; Modjtahedi et al، 2003، Int J Cancer، 105(2):273-80)، TheraCIM hR3 (YM Biosciences، Canada and Centro de Immunologia Molecular، Cuba ؛ البراءة الأمريكية رقم 5،891،996 ورقم. 6،506، 883; Mateo et al، 1997، Immunotechnology، 3(1):71-81)؛ mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Research، Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003، Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX، National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2); and SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138)؛ أليميتوزوماب (Campath®، Millenium)، mAb المعد للاستخدام البشري الذي يتم تطويره حالياً لمعالجة إبيضاض الدم اللمفاوي المزمن المتعلق بالخلية B وميرونوناب- CD3 (Orthoclone OKT3®) ومضاد CD3 الذي تم تطويره عن طريق Ortho Biotech/Johnson & Johnson، وإيبروتوموناب تيوكزينتان (Zevalin®)، ومضاد CD20 تم تطويره عن طريق IDEC/Schering AG، وجيمتوزوماب أوزوجاميسين (Mylotarg®) والجسم المضاد CD33 (بروتين p67) تم تطويره عن طريق Celltech/Wyeth، alefacept (Amevive®) ومضاد اندماج LFA-3 Fc تم تطويره عن طريق Biogen ) وأبسيكزيماب (ReoPro®) تم تطويره عن طريق Centocor/Lilly وباسيليكزيماب (Simulect®) تم تطويره عن طريق Novartis وبالفيزيزوماب (Synagis®) تم تطويره عن طريق Medimmune،أنفليكسيماب (Remicade®) ومضاد ألفا TNF تم تطويره عن طريق Centocor وأدليميوماب (Humira®) والجسم المضاد TNF ألفا تم تطويره عن طريق Abbott، Humicade® والجسم المضاد TNF ألفا تم تطويره عن طريق Celltech وجوليميوماب (CNTO-148) والجسم المضاد TNF البشري الكامل الذي تم تطويره عن طريق Centocor (Enbrel®)، اندماج المستقبل p75 TNF من Fc تم تطويره عن طريق Immunex/Amgen،إينيرسيبت واندماج المستقبل p55TNF من Fc تم تطويره سابقاً عن طريق Roche، ABX-CBL، والجسم المضاد CD147 الذي تم تطويره عن طريق Abgenix و ABX-IL8  الجسم المضاد IL8 الذي تم تطويره عن طريق Abgenix، ABX-MA1 والجسم المضاد MUC18 تم تطويره عن طريق Abgenix وبمتيوموماب (R1549، 90Y-muHMFG1) ومضاد MUC1  ويتم حالياً تطويره عن طريق Antisoma، Therex (R1550) والجسم المضاد MUC1  الذي تم تطويره عن طريق Antisoma،، أنجيو ماب( AS1405)، الذي تم تطويره عن طريق Antisoma، HuBC - 1، التي تم تطويرها عن طريق Antisoma، ثيو بلاتين( AS1407) الذي تم تطويره عن طريق Antisoma، Antegren® (ناتالزوماب) مضاد ألفا - 4 - بيتا 1 ( VLA - 4) ألفا وبيتا - 4 - 7 - الأجسام المضادة التي يتم تطويرها عن طريق Biogen، VLA-1 mAb، مضاد VLA - 1 إنتجرن والأجسام المضادة التي يتم تطويرها عن طريق Biogen، LTBR mAb، مضاد سام ليفي من النوع مستقبل بيتا( LTBR) و الأجسام المضادة التي يتم تطويرها عن طريق Biogen، CAT-152، مضاد TGF - β2 والأجسام المضادة التي يتم تطويرها عن طريق Cambridge Antibody Technology ، ABT 874 (J695)، ،، ومضاد IL-12 p40  والأجسام المضادة التي يتم تطويرها عن طريق Abbott، CAT-192، الأجسام المضادة TGFβ1 والأجسام المضادة التي يتم تطويرها عن طريق Cambridge Antibody Technology and Genzyme، CAT-213، الأجسام المضادة لـEotaxin1 التي يتم تطويرها عن طريق Cambridge Antibody Technology، الأجسام المضادة لـ LymphoStat-B® التي يتم تطويرها عن طريق Cambridge Antibody Technology and Human Genome Sciences Inc - الأجسام المضادة لـ TRAIL-R1mAb – والجسم المضاد TRAIL-R1 الذي يتم تطويره عن طريق Cambridge Antibody Technology and Human Genome Sciences، Inc، و Avastin® bevacizumab، rhuMAb-VEGF)، الجسم المضاد VEGF الذي يتم تطويره عن طريق Genentech، الجسم المضاد لعائلة المستقبل HER الذي يتم تطويره عن طريق Genentech، العامل المضاد للأنسجة (ATF) والجسم المضاد لعامل الأنسجة والذي يتم تطويره عن طريق Genentech، و Xolair® (أومالزوماب) والجسم المضاد لـ IgE والذي يتم تطويره عن طريق Genentech، Raptiva® (إيفالزوماب)، والجسم المضاد CD11a الذي تم تطويره عن طريق Genentech and Xoma، الجسم المضاد MLN-02 (LDP-02 السابق)، والذي تم تطويره عن طريق Genentech and Millenium Pharmaceuticals و HuMax CD4، والجسم المضاد CD4  الذي تم تطويره عن طريق Genmab، الجسم المضاد HuMax-IL15 الذي تم تطويره عن طريق Genmab and Amgen، HuMax-Inflam، التي تم تطويرها عن طريق Genmab and Medarex، HuMax الخاص بالسرطان، مضاد هيباريناز الذي تم تطويره عن طريق Genmab وMedarex و Oxford GcoSciences، HuMax - الخاص بورم الغدد اللمفاوية، والتي تم تطويرها عن طريق Genmab and Amgen، HuMax-TAC التي تم تطويرها عن طريق Genmab، IDEC-131 والجسم المضاد لـ CD40L الذي تم تطويره عن طريق IDEC Pharmaceuticals، IDEC-151 (Clenoliximab)، الجسم المضاد CD4 تم تطويره عن طريق IDEC Pharmaceuticals، IDEC-114، الجسم المضاد CD80 الذي تم تطويره عن طريق IDEC Pharmaceuticals، IDEC-152، الجسم CD23 تم تطويره عن طريق IDEC Pharmaceuticals، الأجسام المضادة لعامل انتقال الخلية الملتهمة الكبيرة (MIF) التي تم تطويرها عن طريق IDEC Pharmaceuticals، BEC2، والأجسام المضادة ذات الأنماط المتفردة التي تم تطويرها عن طريق Imclone، IMC-1C11، والجسم المضاد لـ KDR الذي تم تطويره عن طريق مضاد Imclone، DC101، الجسم المضاد -flk-1 تم تطويره عن طريق Imclone،  أجسام مضادة -VE cadherin تم تطويرها عن طريق Imclone، CEA-Cide® (لابتازوماب)،  الجسم المضاد لمولد ضد كارينوبروينك (CEA) تم تطويره عن طريق Immunomedics، LymphoCide® (Epratuzumab)، الجسم المضاد -CD22 تم تطويره عن طريق Immunomedics، AFP-Cide تم تطويره عن طريق Immunomedics، MyelomaCide، تم تطويره عن طريق Immunomedics، LkoCide تم تطويره عن طريق Immunomedics، ProstaCide تم تطويره عن طريق Immunomedics، MDX-010، الجسم المضاد CTLA4 تم تطويره عن طريق Medarex، MDX-060، الجسم المضاد CD30 تم تطويره عن طريق Medarex، والجسم المضاد MDX-070 تم تطويره عن طريق Medarex، والجسم المضاد MDX-018 تم تطويره عن طريق Medarex، Osidem® (IDM-1)،والجسم المضاد Her2 تم تطويره عن طريق Medarex and Immuno-Designed Molecules، HuMax®-CD4،الجسم المضاد CD4 تم تطويره عن طريق Medarex and Genmab، HuMax-IL15،الجسم المضاد IL15 الذي تم تطويره عن طريق Medarex and Genmab، CNTO 148، الجسم المضاد TNFα تم تطويره عن طريق Medarex and Centocor/J&J، CNTO 1275، جسم مضاد سيتوكين م تطويره عن طريق Centocor/J&J، MOR101 و MOR102، جزيء التصاق بداخل الخلية -1 (ICAM-1) (CD54) والأجسام المضادة التي تم تطويرها عن طريق MorphoSys و MOR201، المستقل 3 لعامل نمو الورم الليفي (FGFR-3)،الجسم المضاد الذي تم تطويره عن طريق MorphoSys، Nuvion® (visilizumab)،والجسم المضاد لـ CD3 الذي تم تطويره عن طريق Protein Design Labs، HuZAF®، الجسم المضاد جاما انترفيرون الذي تم تطويره عن طريق Protein Design Labs، مضاد α 5β1 إنتجرن الذي تم تطويره عن طريق Protein Design Labs،مضاد IL-12 الذي تم تطويره عن طريق Protein Design Labs، ING-1، الجسم المضاد Ep-CAM تم تطويره عن طريق Xoma، Xolair® (Omalizumab)، الجسم المضاد لـ IgE البشري الذي تم تطويره عن طريق Genentech، Novartis، و MLN01، ومضاد بيتا -2 إنتجرن الذي تم تطويره عن طريق Xoma. في نموذج آخر، تشتمل الأدوية العلاجية على KRN330 (Kirin) ؛ الجسم المضاد huA33 (A33، Ludwig Institute for Cancer Research) ؛ CNTO 95 (مركبات إنتجرن ألفا V، Centocor ) ؛ MEDI-522 (مركبات انتجرن Vβ3 ألفا، Medimmune) ؛فلوسيكسيماب (alpha Vβ1 integrin، Biogen/PDL)؛ mAb 216 البشري(قمة لاصقة تمت معالجتها بالجلوكوزيل للخلية B، NCI)؛ BiTE MT103 (CD19 x CD3 ثنائي النوعية ؛ Medimmune)؛ 4G7xH22 (Bispecific BcellxFcgammaR1، Medarex/Merck KGa)؛ rM28 (Bispecific CD28 x MAPG ؛البراءة الأمريكية رقم EP1444268 ) ؛ MDX447 (EMD 82633) (Bispecific CD64 x EGFR، Medarex) وكاتوماكسوماب (ريموفاب) (Bispecific EpCAM x anti-CD3، Trion/Fres)   ؛إيرتوماكسوماب (bispecific HER2/CD3، Fresenius Biotech) ؛ إيروجوفوماب (OvaRex) (CA-125، ViRexx); Rencarex® (WX G250) ؛هيدروكسيداز كربوني IX ؛ Wilex)؛ CNTO 888 (CCL2، Centocor) ؛ TRC105 (CD105 (endoglin)، Tracon) ؛ BMS-663513 (مضاد CD137، Brystol Myers Squibb) ؛ MDX-1342 (CD19، Medarex) ؛سيبليزوماب (MEDI-507) (CD2؛ Medimmune) ؛أوفاتوموماب (Humax-CD20) (CD20، Genmab) ؛ ريتيوزوماب (Rituxan) ؛ (CD20، Genentech) ؛فيلتوزوماب (( hA20) (CD20، Immunomedics) ؛إيبراتوزوماب (CD22، Amgen) ؛ لوميليكيسماب (IDEC 152) (CD23، Biogen) موروموناب- CD3 (CD3، Ortho) ؛ HuM291 (CD3 fc receptor، PDL Biopharma) (HeFi-1، CD30، NCI) ؛ MDX-060 (CD30، Medarex) ؛ MDX-1401 (CD30، Medarex) ؛ SGN-30 (CD30، Seattle Genentics) ؛ SGN-33 (لنتوزوماب) (CD33، Seattle Genentics) ؛ زانوليموماب (HuMax-CD4) (CD4، Genmab) ؛ HCD122 (CD40، Novartis) ؛ SGN-40 (CD40، Seattle Genentics) ؛ Campath1h (ألمتزوماب) (CD52، Genzyme)؛ MDX-1411 (CD70، Medarex) ؛ hLL1 (EPB-1) (CD74.38، Immunomedics ؛جاليكسيمياب (IDEC-144) (CD80، Biogen) ؛ MT293 (TRC093/D93) (كولاجين مشطور، Tracon)  ؛ HuLuc63 (CS1، PDL Pharma) ؛ إيبليموماب (MDX-010) (CTLA4، Brystol Myers Squibb) ؛تريمليميولاب (Ticilimumab، CP-675،2) (CTLA4، Pfizer) ؛ HGS-ETR1 (Mapatumumab) (DR4 TRAIL-R1 agonist، Human Genome Science /Glaxo Smith Kline) ؛ AMG-655 (DR5، Amgen) ؛أبوماب (DR5، Genentech) ؛ CS-1008 (DR5، Daiichi Sankyo)؛ HGS-ETR2 (ليكساتوميوماب) (DR5 TRAIL-R2 agonist، HGS) ؛ سيتوكسيماب (إيربيتوكس) (EGFR، Imclone) ؛ IMC-11F8، (EGFR، Imclone) ؛نيمو توزوماب (EGFR، YM Bio) ؛ بانيتيوموماب (Vectabix) (EGFR، Amgen)؛ زالوتيوزوماب (HuMaxEGFr) (EGFR، Genmab)   ؛ CDX-110 (EGFRvIII، AVANT Immunotherapeutics) ؛أديكاتيوموماب (MT201) (Epcam، Merck)؛ أدريكولوماب (Panorex، 17-1A) (Epcam، Glaxo/Centocor) ؛ MORAb-003 (مستقبل فولات؛ Morphotech) ؛ KW-2871 (ganglioside GD3، Kyowa)؛ MORAb-009 (GP-9، Morphotech) ؛ CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb، Celldex)؛ تراستزوماب (هيرسيبتين) (HER2، Celldex) ؛ بيرتوزوماب (rhuMAb 2C4) HER2 (DI)، Genentech)؛ أبلوزوماب (HLA-DR، سسلة بيتا PDL Pharma) ؛ AMG-479 (IGF-1R، Amgen) ؛مضاد IGF-1R R1507 (IGF1-R، Roche) ؛ CP 751871 (IGF1-R، Pfizer) ؛ IMC-A12 (IGF1-R، Imclone) ؛ BIIB022 (IGF-1R، Biogen)؛ بيتا - Mik (IL-2Rb (CD122) (Hoffman LaRoche) ؛ CNTO 328 (IL6، Centocor) ؛ Anti-KIR (1-7F9) (Killer cell Ig-like Receptor (KIR)، Novo)؛ Hu3S193 (Lewis (y)، Wyeth، Ludwig Institute of Cancer Research) ؛ hCBE-11 (LTßR، Biogen) ؛ HuHMFG1 (MUC1، Antisoma/NCI) ؛ RAV12 ( قمة لاصقة من كربوهيدرات، Raven) ؛ CAL (هرمون الغدة الدرقية المتعلق بالبروتين) PTH-rP)، University of California) ؛ CT-011 (PD1، CureTech)؛ MDX-1106 (ono-4538) (PD1، Medarex/Ono) ؛ MAb CT-011 (PD1، Curetech) ؛ IMC-3G3 (PDGFRa، Imclone) ؛بافيتوكسيماب (فوسفاتيديل سيرين، Peregrine ) ؛ huJ591 (PSMA، Cornell Research Foundation) ؛ muJ591 (PSMA، Cornell Research Foundation) ؛ مثبط GC1008 (TGFb (pan)؛ (IgG4)، Genzyme)؛ إنفلكسيماب (Remicade) ؛ (TNFa، Centocor) ؛ A27.15 (مستقبل ناقل، Salk Institute، INSERN WO 2005/111082 ) ؛ E2.3 (مستقبل ناقل، Salk Institute) ؛بيفاسيزوماب (Avastin) (VEGF، Genentech) ؛ (HuMV833 (VEGF، Tsukuba Research Lab-WO/2000/034337، University of Texas) ؛ IMC-18F1 (VEGFR1، Imclone)؛ IMC-1121 (VEGFR2، Imclone).

ب: تركيب جزيئات DVD

تم تصميم جزيء الجلوبولين المناعي ذي النطاق المتغير الثنائي (DVD-Ig) بحيث يتم ربط اثنين من النطاقات المتغيرة ذات السلسلة الخفيفة (VL) من اثنين من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الأساسية المختلفة أحدهما خلف الآخر أو من خلال رابطة قصيرة عن طريق تقنيات ناتج عودة الارتباط ويلي ذلك النطاق الثابت ذي السلسلة الخفيفة. وعلى نحو مشابه، تشتمل السلسل الثقيلة على اثنين من السلاسل الثقيلة ذات النطاقات لمتغيرة (VH) التي يتم ربطهما أحدهما خلف الآخر عن طريق النطاق الثابت CH1 ومنطقة Fc (الشكل رقم 1أ).

يمكن الحصول على النطاق المتغير عن طريق استخدام تقنيات ناتج عودة الارتباط من الجسم المضاد الأساسي الذي يتم توليده من خلال واحدة من الطرق التي تم وصفها في هذه الوثيقة. في واحد من النماذج، يكون النطاق المتغير عبارة عن النطاق الثقيل الفأري أو النطاق المتغير من السلسلة الخفيفة. في نموذج آخر، يكون النطاق المتغير عبارة عن CDR تم تطعيمه أو نطاق متغير بشري أو نطاق ذي سلسلة خفيفة. في أحد النماذج، يكون المجال المتغير عبارة عن مجال بشري ذي سلسلة ثقيلة أو مجال ذي سلسلة متغيرة خفيفة.

في أحد النماذج، يتم ربط النطاقات الأولى والثانية المتغيرة بشكل مباشر مع بعضها البعض باستخدام تقنيات ناتج عودة الارتباط لـ DNA. في نموذج آخر، يتم ربط النطاقات المتغير من خلال متوالية خاصة برابط. في أحد النماذج، يتم ربط اثنين من النطاقات المتغيرة. يمكن أن يتم ربط ثلاثة أو أكثر من النطاقات بشكل مباشر من خلال متوالية رابطة. تقوم النطاقات المتغيرة بربط نفس مولد الضد أو يمكن أن يتم ربط مولدات الضد المختلفة. يمكن أن تشتمل جزيئات DVD الخاصة بالاختراع على نطاق متغير واحد من الجلوبولين المناعي ونطاق متغير واحد من جلوبولين غير مناعي مثل المجموعة الرابطة لنطاق مستقبل أو نطاق إنزيم فعال. يمكن أن تشتمل جزيئات DVD أيضاً على 2 أو أكثر من نطاقات غير نطاق Ig.

يمكن أن تكون متوالية الرابط عبارة عن حمض أميني منفرد أو متوالية بولي ببتيد. في أحد النماذج يتم اختيار متواليات الرابطة من مجموعة مكونة من AKTTPKLEEGEFSEAR (متوالية رقم 1)؛ AKTTPKLEEGEFSEARV (متوالية رقم 2)؛ AKTTPKLGG (متوالية رقم 3) ؛ SAKTTPKLGG (متوالية رقم 4)؛ SAKTTP (متوالية رقم 5) ؛ RADAAP (متوالية رقم 6) ؛ RADAAPTVS (متوالية رقم 7) ؛ RADAAAAGGPGS (متوالية رقم 8)؛ RADAAAA(G₄S)₄ (متوالية رقم 9)؛ SAKTTPKLEEGEFSEARV (متوالية رقم 10) ؛ ADAAP (متوالية رقم 11) ؛ ADAAPTVSIFPP (متوالية رقم 12) ؛ TVAAP (متوالية رقم 13) ؛ TVAAPSVFIFPP (متوالية رقم 14)؛ QPKAAP (متوالية رقم 15)؛ QPKAAPSVTLFPP (متوالية رقم 16)؛ AKTTPP (متوالية رقم 17)؛ KTTPPSVTPLAP (متوالية رقم 18 )؛ akttap (متوالية رقم 19 )؛ akttapsvyplap (متوالية رقم 20)؛ ASTKGP (متوالية رقم 21)؛ ASTKGPSVFPLAP (متوالية رقم 22)؛ GGGGSGGGGSGGGGS (متوالية رقم 23)؛ GENKVEYAPALMALS (متوالية رقم 24 )؛ GPAKELTPLKEAKVS (متوالية رقم 25 )؛ وGHEAAAVMQVQYPAS (متوالية رقم 26).

يعتمد اختيار متواليات الرابط على تحليل البنية البللورية للعديد من جزيئات Fab. وهناك رابطة مرنة طبيعية بين النطاقات المتغيرة والنطاق الثابت الخاص بـ CH1/C وذلك في Fab أو أي بنية جزيئية للجسم المضاد. تشتمل تلك الرابطة الجزيئية على حوالي 10-12 وحدة بنائية من وحدت الحمض الأميني، يتم الإسهام بها عن طريق 4-6 وحدات من الطرف C  من النطاق V و4-6 وحدات بنائية من النطاق N من نطاق CL/CH1. تم تخليق DVD Igs الخاصة بالاختراع باستخدام الطرف N و5-6 من الوحدات البنائية للحمض الأميني أو 11-12 من لوحدات البنائية للحمض الأميني من CL أو CH1 مثلما هو الحال مع الرابط ذي السلسلة الخفيفة والسلسلة الثقيلة من DVD-Ig على الترتيب. تكون الوحدات البنائية من الطرف N من النطاقات CL  أو CH1. وعلى نحو محدد فإن الوحدات البنائية للحمض الأميني 5-6 يكون لها شكل حلقة بدون الوحدات البنائية الثانوية القوية، وبالتالي يمكن أن تعمل كروابط مرنة بين اثنين من النطاقات المتغيرة. تكون الوحدات البنائية من الطرف N من النطاقات CL أو CH1 عبارة عن امتداد طبيعي للنطاقات المتغيرة حيث أنها جزء من متوالية Ig وبالتالي تقلل إلى مدى بعيد أي توليد مناعة يمكن أن ينتج من الراوبط ومجموعات الإضافة.

يمكن أن تشتمل متواليات الرابط الأخرى على أي متوالية لها طول نطاق CL/CH1 ولكن كل الروابط من نطاقات CL/CH1 من وحدات الحمض الأميني الأول ونطاقات CL/CH1؛ يمكن أن تشكل روابط السلسلة الخفيفة من Ck أو Cl والروابط ذات السلسلة الثقيةل التي يمكن اشتقاقها من الأنماط المتماثلة والتي تشتمل على Cγ2، Cγ3، Cγ4، Cα، Cα2، Cδ، Ce و µ C،والتي يمكن أن يتم اشتقاقها من البروتينات الأخرى مثل بروتينات شبيهة بـ Ig (على سبيل المثال TCR، FcR، KIR)؛ G/S بالاعتماد على (على سبيل المثال الوحدات المتكررة من G4S متوالية رقم: 27) والمتواليات التي تم اشتقاقها من منقطة المفصل والمتواليات الطبيعية الأخرى من بروتينات أخرى.

 في أحد النماذج يتم ربط النطاق الثابت باثنين من النطاقات المتغيرة المرتبطة مثل تقنيات ناتج عن عودة الارتباط. في أحد النماذج، تشتمل المتوالية على السلسلة الثقيلة المرتبطة ذات السلسلة الثقيلة والمتوالية التي تشتمل على النطاق الخفيف المتغير بالنطاق الثابت من السلسلة الثقيلة والمتوالية التي تشتمل على النطاقات المتغيرة الخفيفة المرتبطة بالنطاق الثابت من السلسلة الخفيفة. في أحد النماذج، يكون المجال الثابت عبارة عن مجال ثابت بشري من السلسلة الثقيلة والنطاق الثابت ذي السلسلة الخفيفة البشرية على التوالي. في أحد النماذج، ترتبط DVD أيضاً بالمنطقة Fc. يمكن أن تكون منطقة Fc عبارة عن منطقة متوالية أساسية أو منطقة Fc متغيرة. في نموذج آخر، تكون Fc عبارة عن منطقة Fc بشرية. في نماذج أخرى تشتمل منطقة Fc على منطقة Fc من IgG1، IgG2، IgG3، IgG4، IgA، IgM، IgE، أو IgD،.

في نموذج آخر، يتم دمج اثنين من السلاسل الثقيلة من بولي ببتيدات DVD واثنين من السلاسل الخفيفة من بولي ببتيدات DVD والتي يتم دمجها لكي يتم تشكيل جزيء DVD-Ig. يبين الجدول رقم 2 قوائم متواليات الحمض الأميني الخاصة بمناطق VH أو VL على سبيل المثال الأجسام المضادة الخاصة بالمستهدفات المفيدة في معالجة أمراض مثل معالجة الورم. في أحد النماذج يوفر الاختراع DVD يشتمل على الأقل على اثنين من مناطق VH و/أو VL التي تم توضيحها في الجدول رقم 2 وذلك في أي اتجاه.