Redistribution d'extraits pour des données quantitatives
Pour permettre des comparaisons valables, toutes les données doivent être exprimées sur une base quantitative
(par exemple, activité par mg d'extrait). Les extraits doivent donc être séchés et ensuite
redissous pour constituer une concentration connue de l'extrait. Fréquemment, séché
les différents tissus ne sont pas librement solubles même si le même solvant est utilisé, ce qui entraîne
des complications. Pour éviter ce problème, nous ne faisons pas sécher d'extraits. Pour déterminer la concentration
tration de l'extrait à des fins de quantification, nous prenons une petite partie aliquote, la séchez et
utiliser les valeurs obtenues pour calculer la concentration initiale [37].
Stockage des extraits
Les extraits sont conservés à une température comprise entre 3 et 7 ° C et non dans un congélateur où des précipitations peuvent se produire.
Nous avons eu du mal à stocker les extraits aqueux car, selon notre expérience, les champignons
la croissance se produit invariablement après un certain temps, même à basses températures. C'est prob-
car de bonnes ressources en carbone et en azote pour la croissance fongique telles que les sucres
et des acides aminés peuvent être présents dans les extraits aqueux.
La sélection des récipients utilisés pour stocker les extraits d'acétone est importante. Acétone
extraits perdent jusqu'à 87% de l'acétone s'ils sont stockés dans des récipients en verre contenant du polyéthy-
lene stoppers à 40 ° C pendant un mois. Dans l’ensemble, le film de téflon est le meilleur, suivi du
papier d'aluminium et les bouchons en polyéthylène [38].
On pourrait s’attendre à ce que les extraits secs soient très stables, mais nous avons été surpris
que les extraits à l’acétone des membres des Combretaceae conservent des propriétés antibactériennes et
activité anti-inflammatoire sur des périodes prolongées, même en cas de stockage dans un
état à la température ambiante [23]. Cela peut être dû aux propriétés antibactériennes et antifongiques
activité de ces composés [21, 27].
Évaluation de l'activité antimicrobienne quantitative
Les techniques de diffusion en gélose sont largement utilisées pour doser des extraits de plantes à des fins antimicrobiennes.
activité, mais il y a des problèmes associés à cette technique. Une microdilution
Cette technique a été mise au point à l’aide de microplaques à 96 puits et de sels de tétrazolium pour
croissance bactérienne de cate [39]. Le violet p -Iodonitrotetrazolium (0,2 mg mL - 1 ) a donné de meilleurs résultats.
résultats que le rouge de tétrazolium ou le bleu de thiazolyle. La méthode est rapide, a bien fonctionné
avec Staphylococcus aureus , Enterococcus faecalis , Pseudomonas aeruginosa et Escherichia
coli et avec des extraits non aqueux de nombreuses plantes différentes. Ces bac-
5.8 L' évaluation quantitative Activité antimicrobienne 105
ont été sélectionnées car elles sont responsables de la plupart des maladies nosocomiales.
se détend dans les hôpitaux [40]. La méthode donne des résultats reproductibles, ne nécessite que
10-25 μ L d'extrait pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI), distin-
entre les effets microcidaux et microstatiques et procure un effet permanent
enregistrement des résultats. À l'aide de S. aureus et d'un extrait de Combretum molle , la technique
était 32 fois plus sensible que les techniques de diffusion à la gélose et n'était pas sensible
jusqu'à l'âge de culture de l'organisme d'essai jusqu'à 24 h [39]. La culture de S. aureus pourrait être
conservés jusqu’à 10 jours dans une chambre froide avec peu d’effet sur les résultats du test. Cette meth-
od est utile pour le dépistage de l’activité antimicrobienne chez les plantes et pour la
isolement chimique de composés antimicrobiens à partir de plantes. Valeurs MIC déterminées pour
sulfisoxazole, norfloxacine, gentamicine et nitrofurantoïne étaient similaires aux valeurs
indiqué dans la littérature mais les valeurs obtenues avec le triméthroprim et l'ampicilline
étaient plus élevés avec certaines bactéries [39]. Cette méthode fonctionne également bien avec les champignons [27].
Évaluation de l'activité biologique qualitative
La bioautographie peut déterminer le nombre de composés biologiquement actifs
présent dans un extrait ou peut être utilisé pour assurer la compatibilité d'un composé isolé plus tôt
pas isolé à nouveau.
Les composants d'un extrait sont séparés, généralement par CCM. Si microorganismes
peut se développer sur la plaque, il est généralement facile de déterminer la valeur R f du composé
qui inhibe la croissance. Certains auteurs ont essayé d'éponger la plaque de CCM humide avec un filtre
papier, puis pulvériser sur le papier filtre une culture de l’organisme d’essai. Autres
ont appliqué une couche d'agar sur le chromatogramme en pulvérisant avec un liquide semi-liquide
gélose contenant l'organisme d'essai.
Aucune de ces techniques n'a donné de bons résultats entre nos mains. Nous avons essayé la pulvérisation
la culture directement sur le chromatogramme, mais il est difficile de visualiser les microbes
croissance. Si un champignon ayant des spores visibles est utilisé, cela fonctionne. Nous avons ensuite utilisé un
technique développée par Begue et Kline [41]. Dans cette technique, l’éluant est re-
déplacé du chromatogramme, qui est pulvérisé avec un microbien concentré
suspension et après une nuit d'incubation, le chromatogramme est pulvérisé avec du
violet de razolium. La croissance microbienne est indiquée par les zones rouge-violet et l'inhibition par
zones dégagées. Cette méthode a très bien fonctionné avec les bactéries aérobies (Fig. 5.1). Par ajout
dioxyde de carbone et en incluant anaerocult la méthode a également bien fonctionné avec
bactéries micro-aérophiles / anaérobies [42].
La technique de bioautographie est plus difficile avec les champignons car ils se développent
plus lent et la contamination peut être un problème. Nous avons réussi à développer un
technique qui fonctionne bien avec plusieurs champignons, y compris C. albicans [43].
Les techniques bioautographiques fonctionnent extrêmement bien si l’activité antioxydante est déterminée.
en utilisant le DPPH à radicaux libres (1,1-diphényl-2-picryl-hydrazyle) comme solution de pulvérisation.
agent (Fig. 5.2).
En appliquant ces techniques qualitatives, on peut avoir une bonne idée de ce qui
les espèces seraient les plus intéressantes à approfondir. En comparant bioau-
106 5 Extraits de plantes utilisés pour lutter contre les infections bactériennes, fongiques et parasitaires en Afrique australe
des programmes mesurant différentes activités, on peut identifier des composés présentant des propriétés antibactériennes.
activités rial, antifongique et antioxydant.
Expression des résultats
Les auteurs ont utilisé différentes manières d’exprimer l’activité biologique des plantes
tracts basés sur la technique utilisée. Au début, la méthode de diffusion sur gélose a conduit à
les résultats étant exprimés dans la largeur de la zone d'inhibition. Plus tard, les valeurs MIC de
5.10 Expression des résultats 107
Fig. 5.1 Bioautographie d'extraits de feuilles d'acétone de huit espèces de Combretum
pulvérisé avec Enterococcus faecali s, incubé, puis pulvérisé avec du tétrazolium
violet. Les zones blanches indiquent la présence de composés antibactériens.
Fig. 5.2 Activité antioxydante d'extraits de feuilles d'acétone de plusieurs Combretum
espèce déterminée par pulvérisation avec une solution méthanolique de DPPH. Zones blanches
indiquer la présence de composés antioxydants dans les extraits.
les extraits ont été déterminés. Ces deux techniques ont fourni des informations sur les activités
des extraits et ont été utilisés pour isoler des composants biologiquement actifs ou pour évaluer
savoir si l’utilisation ethnobotanique des plantes pouvait être justifiée. Ces techniques
a donné peu d'informations quantitatives sur les plantes. Nous avons proposé que la quantité
de la matière extraite de 1 g de matière végétale séchée peut être divisé par la valeur de la CMI
pour donner l'activité totale de la plante. L'unité est mL g - 1 , et indique le plus grand
volume auquel les composés biologiquement actifs dans 1 g peuvent être dilués et encore
inhiber la croissance des bactéries. Si les résultats d’autres essais biologiques sont également exprimés en
quantité relative d'activité présente dans les plantes étudiées, la plus prometteuse
les plantes à utiliser dans les zones rurales pour les soins de santé traditionnels peuvent être identifiées [44].
Cette technique peut également être très utile pour le fractionnement basé sur un essai biologique si le
l'activité totale d'une fraction est exprimée en millilitres par fraction en divisant le
masse en milligrammes par CMI en mg mL - 1 . Ce volume indique à quel niveau
cette fraction peut être diluée tout en inhibant la croissance de l'organisme testé. En suivant
En adoptant cette approche, toute perte d’activité est rapidement détectée et permet d’assurer que
composés ologiquement actifs ne sont pas isolés dans la conviction erronée qu'ils sont
principaux composants actifs [37].
Activité antibactérienne
La plupart des recherches menées dans le cadre du programme de phytomédecine comprennent des études
sur l’activité antibactérienne des plantes. C’est principalement une conséquence de la
développement de la méthode de dilution en série rapide et reproductible [39] utilisée pour
conservation des valeurs de CMI des extraits de plantes par rapport aux espèces bactériennes. Comme indiqué précédemment,
le ton est systématiquement sélectionné comme solvant pour préparer les extraits pour le criblage initial
processus car ce solvant parmi plusieurs testés a été trouvé pour donner les meilleurs résultats avec
référence à la quantité et à la diversité des composés extraits, nombre d'inhibiteurs
extrait, toxicité dans un essai biologique et facilité d'élimination du solvant, entre autres facteurs
[33] Les techniques bioautographiques [41, 45] décrites précédemment sont également utilisées pour
estimer le nombre et les valeurs R f des constituants antibactériens dans un extrait de plante de
intérêt.
Les organismes d’essai que nous utilisons couramment dans le criblage préliminaire des plantes
les voies d’activité antibactérienne sont les Enterococcus faecalis à Gram positif (ATCC
29212) et Staphylococcus aureus (ATCC 29213) et Escherichia à Gram négatif.
coli (ATCC 27853) et Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25922). Ces références ATCC
Des souches de référence sont recommandées par le Comité national de recherche en laboratoire clinique.
Standards (NCCLS), Villanova, Pennsylvanie, États-Unis, pour les tests antibactériens [46]. nous
ont récemment inclus une souche de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline et
Mycobacterium smegmatis dans la gamme des bactéries contre lesquelles l'activité est testée.
Une pléthore de publications ont rapporté l’activité antibactérienne de l’Afrique du Sud.
extraits de plantes et les composés qui en sont isolés à l’aide de la fragmentation dirigée
tionation (voir, par exemple, refs [47 - 56]). Il y a beaucoup de recherches en cours
dans ce domaine et beaucoup d’informations utiles et intéressantes sont générées.
108 5 Extraits de plantes utilisés pour lutter contre les infections bactériennes, fongiques et parasitaires en Afrique australe
Pour permettre des comparaisons valables, toutes les données doivent être exprimées sur une base quantitative
(par exemple, activité par mg d'extrait). Les extraits doivent donc être séchés et ensuite
redissous pour constituer une concentration connue de l'extrait. Fréquemment, séché
les différents tissus ne sont pas librement solubles même si le même solvant est utilisé, ce qui entraîne
des complications. Pour éviter ce problème, nous ne faisons pas sécher d'extraits. Pour déterminer la concentration
tration de l'extrait à des fins de quantification, nous prenons une petite partie aliquote, la séchez et
utiliser les valeurs obtenues pour calculer la concentration initiale [37].
Stockage des extraits
Les extraits sont conservés à une température comprise entre 3 et 7 ° C et non dans un congélateur où des précipitations peuvent se produire.
Nous avons eu du mal à stocker les extraits aqueux car, selon notre expérience, les champignons
la croissance se produit invariablement après un certain temps, même à basses températures. C'est prob-
car de bonnes ressources en carbone et en azote pour la croissance fongique telles que les sucres
et des acides aminés peuvent être présents dans les extraits aqueux.
La sélection des récipients utilisés pour stocker les extraits d'acétone est importante. Acétone
extraits perdent jusqu'à 87% de l'acétone s'ils sont stockés dans des récipients en verre contenant du polyéthy-
lene stoppers à 40 ° C pendant un mois. Dans l’ensemble, le film de téflon est le meilleur, suivi du
papier d'aluminium et les bouchons en polyéthylène [38].
On pourrait s’attendre à ce que les extraits secs soient très stables, mais nous avons été surpris
que les extraits à l’acétone des membres des Combretaceae conservent des propriétés antibactériennes et
activité anti-inflammatoire sur des périodes prolongées, même en cas de stockage dans un
état à la température ambiante [23]. Cela peut être dû aux propriétés antibactériennes et antifongiques
activité de ces composés [21, 27].
Évaluation de l'activité antimicrobienne quantitative
Les techniques de diffusion en gélose sont largement utilisées pour doser des extraits de plantes à des fins antimicrobiennes.
activité, mais il y a des problèmes associés à cette technique. Une microdilution
Cette technique a été mise au point à l’aide de microplaques à 96 puits et de sels de tétrazolium pour
croissance bactérienne de cate [39]. Le violet p -Iodonitrotetrazolium (0,2 mg mL - 1 ) a donné de meilleurs résultats.
résultats que le rouge de tétrazolium ou le bleu de thiazolyle. La méthode est rapide, a bien fonctionné
avec Staphylococcus aureus , Enterococcus faecalis , Pseudomonas aeruginosa et Escherichia
coli et avec des extraits non aqueux de nombreuses plantes différentes. Ces bac-
5.8 L' évaluation quantitative Activité antimicrobienne 105
ont été sélectionnées car elles sont responsables de la plupart des maladies nosocomiales.
se détend dans les hôpitaux [40]. La méthode donne des résultats reproductibles, ne nécessite que
10-25 μ L d'extrait pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI), distin-
entre les effets microcidaux et microstatiques et procure un effet permanent
enregistrement des résultats. À l'aide de S. aureus et d'un extrait de Combretum molle , la technique
était 32 fois plus sensible que les techniques de diffusion à la gélose et n'était pas sensible
jusqu'à l'âge de culture de l'organisme d'essai jusqu'à 24 h [39]. La culture de S. aureus pourrait être
conservés jusqu’à 10 jours dans une chambre froide avec peu d’effet sur les résultats du test. Cette meth-
od est utile pour le dépistage de l’activité antimicrobienne chez les plantes et pour la
isolement chimique de composés antimicrobiens à partir de plantes. Valeurs MIC déterminées pour
sulfisoxazole, norfloxacine, gentamicine et nitrofurantoïne étaient similaires aux valeurs
indiqué dans la littérature mais les valeurs obtenues avec le triméthroprim et l'ampicilline
étaient plus élevés avec certaines bactéries [39]. Cette méthode fonctionne également bien avec les champignons [27].
Évaluation de l'activité biologique qualitative
La bioautographie peut déterminer le nombre de composés biologiquement actifs
présent dans un extrait ou peut être utilisé pour assurer la compatibilité d'un composé isolé plus tôt
pas isolé à nouveau.
Les composants d'un extrait sont séparés, généralement par CCM. Si microorganismes
peut se développer sur la plaque, il est généralement facile de déterminer la valeur R f du composé
qui inhibe la croissance. Certains auteurs ont essayé d'éponger la plaque de CCM humide avec un filtre
papier, puis pulvériser sur le papier filtre une culture de l’organisme d’essai. Autres
ont appliqué une couche d'agar sur le chromatogramme en pulvérisant avec un liquide semi-liquide
gélose contenant l'organisme d'essai.
Aucune de ces techniques n'a donné de bons résultats entre nos mains. Nous avons essayé la pulvérisation
la culture directement sur le chromatogramme, mais il est difficile de visualiser les microbes
croissance. Si un champignon ayant des spores visibles est utilisé, cela fonctionne. Nous avons ensuite utilisé un
technique développée par Begue et Kline [41]. Dans cette technique, l’éluant est re-
déplacé du chromatogramme, qui est pulvérisé avec un microbien concentré
suspension et après une nuit d'incubation, le chromatogramme est pulvérisé avec du
violet de razolium. La croissance microbienne est indiquée par les zones rouge-violet et l'inhibition par
zones dégagées. Cette méthode a très bien fonctionné avec les bactéries aérobies (Fig. 5.1). Par ajout
dioxyde de carbone et en incluant anaerocult la méthode a également bien fonctionné avec
bactéries micro-aérophiles / anaérobies [42].
La technique de bioautographie est plus difficile avec les champignons car ils se développent
plus lent et la contamination peut être un problème. Nous avons réussi à développer un
technique qui fonctionne bien avec plusieurs champignons, y compris C. albicans [43].
Les techniques bioautographiques fonctionnent extrêmement bien si l’activité antioxydante est déterminée.
en utilisant le DPPH à radicaux libres (1,1-diphényl-2-picryl-hydrazyle) comme solution de pulvérisation.
agent (Fig. 5.2).
En appliquant ces techniques qualitatives, on peut avoir une bonne idée de ce qui
les espèces seraient les plus intéressantes à approfondir. En comparant bioau-
106 5 Extraits de plantes utilisés pour lutter contre les infections bactériennes, fongiques et parasitaires en Afrique australe
des programmes mesurant différentes activités, on peut identifier des composés présentant des propriétés antibactériennes.
activités rial, antifongique et antioxydant.
Expression des résultats
Les auteurs ont utilisé différentes manières d’exprimer l’activité biologique des plantes
tracts basés sur la technique utilisée. Au début, la méthode de diffusion sur gélose a conduit à
les résultats étant exprimés dans la largeur de la zone d'inhibition. Plus tard, les valeurs MIC de
5.10 Expression des résultats 107
Fig. 5.1 Bioautographie d'extraits de feuilles d'acétone de huit espèces de Combretum
pulvérisé avec Enterococcus faecali s, incubé, puis pulvérisé avec du tétrazolium
violet. Les zones blanches indiquent la présence de composés antibactériens.
Fig. 5.2 Activité antioxydante d'extraits de feuilles d'acétone de plusieurs Combretum
espèce déterminée par pulvérisation avec une solution méthanolique de DPPH. Zones blanches
indiquer la présence de composés antioxydants dans les extraits.
les extraits ont été déterminés. Ces deux techniques ont fourni des informations sur les activités
des extraits et ont été utilisés pour isoler des composants biologiquement actifs ou pour évaluer
savoir si l’utilisation ethnobotanique des plantes pouvait être justifiée. Ces techniques
a donné peu d'informations quantitatives sur les plantes. Nous avons proposé que la quantité
de la matière extraite de 1 g de matière végétale séchée peut être divisé par la valeur de la CMI
pour donner l'activité totale de la plante. L'unité est mL g - 1 , et indique le plus grand
volume auquel les composés biologiquement actifs dans 1 g peuvent être dilués et encore
inhiber la croissance des bactéries. Si les résultats d’autres essais biologiques sont également exprimés en
quantité relative d'activité présente dans les plantes étudiées, la plus prometteuse
les plantes à utiliser dans les zones rurales pour les soins de santé traditionnels peuvent être identifiées [44].
Cette technique peut également être très utile pour le fractionnement basé sur un essai biologique si le
l'activité totale d'une fraction est exprimée en millilitres par fraction en divisant le
masse en milligrammes par CMI en mg mL - 1 . Ce volume indique à quel niveau
cette fraction peut être diluée tout en inhibant la croissance de l'organisme testé. En suivant
En adoptant cette approche, toute perte d’activité est rapidement détectée et permet d’assurer que
composés ologiquement actifs ne sont pas isolés dans la conviction erronée qu'ils sont
principaux composants actifs [37].
Activité antibactérienne
La plupart des recherches menées dans le cadre du programme de phytomédecine comprennent des études
sur l’activité antibactérienne des plantes. C’est principalement une conséquence de la
développement de la méthode de dilution en série rapide et reproductible [39] utilisée pour
conservation des valeurs de CMI des extraits de plantes par rapport aux espèces bactériennes. Comme indiqué précédemment,
le ton est systématiquement sélectionné comme solvant pour préparer les extraits pour le criblage initial
processus car ce solvant parmi plusieurs testés a été trouvé pour donner les meilleurs résultats avec
référence à la quantité et à la diversité des composés extraits, nombre d'inhibiteurs
extrait, toxicité dans un essai biologique et facilité d'élimination du solvant, entre autres facteurs
[33] Les techniques bioautographiques [41, 45] décrites précédemment sont également utilisées pour
estimer le nombre et les valeurs R f des constituants antibactériens dans un extrait de plante de
intérêt.
Les organismes d’essai que nous utilisons couramment dans le criblage préliminaire des plantes
les voies d’activité antibactérienne sont les Enterococcus faecalis à Gram positif (ATCC
29212) et Staphylococcus aureus (ATCC 29213) et Escherichia à Gram négatif.
coli (ATCC 27853) et Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25922). Ces références ATCC
Des souches de référence sont recommandées par le Comité national de recherche en laboratoire clinique.
Standards (NCCLS), Villanova, Pennsylvanie, États-Unis, pour les tests antibactériens [46]. nous
ont récemment inclus une souche de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline et
Mycobacterium smegmatis dans la gamme des bactéries contre lesquelles l'activité est testée.
Une pléthore de publications ont rapporté l’activité antibactérienne de l’Afrique du Sud.
extraits de plantes et les composés qui en sont isolés à l’aide de la fragmentation dirigée
tionation (voir, par exemple, refs [47 - 56]). Il y a beaucoup de recherches en cours
dans ce domaine et beaucoup d’informations utiles et intéressantes sont générées.
108 5 Extraits de plantes utilisés pour lutter contre les infections bactériennes, fongiques et parasitaires en Afrique australe
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