تحضير القطاعات النباتية

تحضير القطاعات النباتية

الأهداف:

1-      لمعرفة آلية عمل مقطع يدوى واختباره بالميكروسكوب الضوئي.
2-      التمييز بين أشكال الخلايا في كل من الساق والجذر والاوراق
3-      لدراسة آلية الكشف عن معظم المركبات في الخلايا

ومن خلال دراسة المقاطع المصبوغة سنتعرف على أشكال الأنسجة المختلفة

   أولاً محاليل حفظ العينات:

1- محلول التثبيت  F.A    .A  (Formaline  Acetic Acid glacial)
يستعمل لحفظ عينات الجذور والسيقان والأوراق والقمم النامية ويتكون من:-
-90 مل كحول ايتلى ( 70% )
-5 مل حمض خليك ثلجي
-5 مل فورمالين
الوقت المتبع في حالة هذا الحافظ 18 ساعة
   
2- محلول كارنوى :-
-30 مل كحول اثيلى مطلق (100%)
-5مل حمض الخليك
-5 مل كلورفوم
يستخدم للعينات الرقيقة كقمة جذرا أو أجزاء الزهور
مدة التثبيت:-  ساعة واحدة
ملاحظات:-
1-      لا يزيد حجم العينة عن 0.5  سم
2-      أن يكون المثبت عشر أضعاف حجم النسيج على الأقل
3-      مراعاة مدة المثبت.

ثانيا التحضير:
هناك ثلاث مراحل اساسية لتحضير مقطع يمكن استخدامة في دراسة الانسجة او المقارنة بينها:

- الحصول على المقطع:
يجب محاولة الحصول على مقطع رقيق جدا ويجب ان تكون عملية القطع عمودية على الجزء النباتي كما يظهر في الشكل:
من اجل القطع اليدوي والحصول على ارق المقاطع الممكنة دون تمزق الانسجة النباتية, يجب استعمال مادة خاصة قلب نبات البيلسانThe  Pith of Elder Tree وهو من انجع المواد المستعملة وهدف استعمال هذة المادة هو التحكم في الجزء النباتي وعدم تشوية المقطع, يمكن ايضا استبدال هذة المادة  بمواد مناسبة تقوم بنفس العمل مثل الفلين او البوليستير (Polysterene)او البطاطس او الجذر.

طريقة الاستعمال تكون على النحو التالي:

A)     الطريقة اليدوية:

-  إغسل العينة بالماء الجار لترطيبها.
-   أزل الأجزاء الطرفية ليستوي سطح العينة
-        خذ قطعة من مادة البوليستير وأقسمها قسمين
-        افحر في القسمين حفرا مناسبا تماما لحجم المقطع النباتي المراد استعمالة
-        ضع الجزء النباتي داخل الفتحة التي اعدت لة
-  إغلق الجزئيين وبواسطة شفرة او موس حاد اقطع ارق جزء ممكن (015 الى 20 ميكرون) مراعيا ان تكون الشفرة عمودية على المقطع كما يظهر في الرسم:
-        انقل القطاعات إلى زجاجة ساعة تحوى ماء و بواسطة الفرشاة اختبر ارق القطاعات واما تفحص بالماء مباشرة أو هناك آليات صباغة سنتعرض لها





B)     طريقة الميكروتوم:-

وهناك ميكروتوم يدوى وميكروتوم اّلى وممكن الحصول منها على عدة أنواع من القطاعات

الصبغ:

ممكن أن نستخدم صبغة واحدة او اكثر من صبغة وسنتعرض الى عدة طرق صباغة كالآتي:

 الصباغة بصبغة واحدة:
- يعد تجهيز المقاطع كما سبق ,يتم نقلها من وعاء الماء إلى زجاجة بها صبغة Toluidine blue     وتصبغ لمدة 15 ثانية
- انقل العينة مباشرة إلى وعاء به ماء للغسيل
-  حمل على شريحة نظيفة
ممكن التحميل بالماء أو بواسطة وسط تحميل آخركالجليسرين.

هناك صبغات تتناسب بعض المكونات في الخلايا مثلا:

1-      النشاStarch  :
- اغمس المقطع فيIKI   لمدة 15 وهو متكون من
أيود يد البوتاسيوم 2 % + محلول مائي لليود 0.2  %
- يغسل المقطع في الماء ثم يحمل بالماء آوالجليسرين.

2- البروتين Protein :
- يغمس المقطع في Naphthol blue black      لمدة دقيقة
- ينقل إلى 7% حمض خليك
- ينقل إلى الماء ويحمل بالماء.

3- الدهون: Lipids   
- يغمس  المقطع في اسود سودانB   لمدة دقيقة
- ينقل المقطع إلى 70% ايثانول
- ينقل للماء ويحمل بالماء

4- اللجنين:  Lignin     :
- يغمس المقطع في محلول فلورو جلوسينول من دقيقة إلى دقيقتين
- ينقل إلى الماء ويحمل بالماء.

5- الكالوس Callose     :
- يغمس في  IKI  لمدة دقيقتين
- ينقل للماء
- ينقل إلى الانيلين الأزرق لمدة خمس دقائق
- ينقل للماء ويحمل بالماء

الصبغات المزدوجة:  Double Staining       :

تستخدم الصبغات المزدوجة لصباغة الاجزاء النباتية المختلفة في المقطع الواحد وذلك حسب طبيعة تلك الاجزاء فمثلا الانسجة البارانشمية تتلون باللون الأخضر بينما الأنسجة الملجنية باللون الأحمر لون السفرانين.

ممكن استخدام عينة محفوظة في كحول 70 % أو طازجة  وسنستخدم طريقة الصباغة باستخدام  صبغة السفرانين Safranine وصبغة الأخضر الخفيفLight Green.

1-      تنقل العينات الطازجة من الماء إلى زجاجة ساعة بها 30 % كحول
2-      تنقل العينات إلى كحول  بتركيز  50 % مدة ثلاث دقائق
3-      تغمس العينات في صبغة السفرانين لمدة ثلاث دقائق- 7 دقائق
4-      تنقل العينات داخل تركيزات من الكحول مختلفة  70 %  (3  min) ، 80  % (3 min)،90  % (3 min)
5-      تغمس القطاعات في صبغة الأخضر الخفيف 3-5 ثوان
6-      تنقل إلى كحول 95 % ( 3 min)
7-      كحول مطلق 100 %   (5 min)
8-      كحول مطلق + زايلول  (1:1) 3   min
9-      زايلول (5 min) فقط
10-    تحمل العينات على كندا بلسم للحصول على شرائح دائمة