إنتاج بروتينات DVD


انتاج بروتينات DVD
خطوات تصنيع البروتين
اين يتم تصنيع البروتين في الخلية
خطوات تصنيع البروتينات في الجسم
بناء البروتين في الخلية
خطوات تخليق البروتين
تخليق البروتين pdf
بناء البروتين ppt
عملية النسخ والترجمة في dna

يمكن إنتاج بروتينات الربط الخاصة بالاختراع الحالي بأي من الأساليب المعروفة في المجال. فعلى سبيل المثال، هناك التعبير الوراثي من الخلايا العائلة، حيث يتم نقل العدوى للناقل (النواقل) المرمز لسلسل DVD الثقيلة والخفيفة إلى خلية عائلة بإتباع الأساليب التقليدية. والهدف من مختلف أشكال مصطلح "نقل العدوى" أن يشمل العديد من الأساليب التي يتم استخدامها عادة في إدخال DNA خارجي المنشأ في خلية عائلة بدائية النواة أو حقيقية النواة، مثل النقل الكهربي، وترسيب فوسفات الكالسيوم، ونقل عدوى DEAE - ديكستران وما شابه ذلك. وعلى الرغم من إمكانية التعبير عن بروتينات DVD الخاصة بالاختراع سواء في الخلايا العائلة بدائية النواة أو حقيقية النواة، إلا أنه يتم التعبير عن بروتينات DVD في الخلايا حقيقية النواة، مثل الخلايا العائلة للثدييات، لأن الخلايا حقيقية النواة (وخاصة خلايا الثدييات) أكثر ميلاً من الخلايا بدائية النواة لأن تجمع وتفرز بروتين DVD مطوي بشكل مناسب ونشط مناعياً.
ومن أمثلة خلايا الثدييات العائلة للتعبير الوراثي عن أجسام مضادة ناتجة عن عودة الارتباط الجيني الخاصة بالاختراع المبيض الصيني (خلايا CHO) (مثل خلايا CHO - dhfr، التي تم وصفها في Urlaub and Chasin، (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220، المستخدمة الموصوفة، المستخدمة مع مرقم DHFR يمكن اختياره، مثلما تم وصفه في R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)، وخلايا الورم النخاعي NS0، وخلايا COS، وخلايا SP2 و PER.C6. وعند إدخال نواقل التعبير التي ترمز بروتينات DVD في خلايا الثدييات العائلة، يتم إنتاج بروتينات DVD عن طريق زراعة الخلايا العائلة لمدة كافية من الزمن للسماح بالتعبير الوراثي عن بروتينات DVD في الخلايا العائلة أو إفراز بروتينات DVD في وسط الزراعة الذي تنمو فيه الخلايا العائلة. ويمكن استخراج بروتينات DVD من وسط الزراعة باستخدام طرق تنقية البروتين القياسية.
في نظام تمثيلي للتعبير الوراثي الناتج عن عودة الارتباط الجيني لبروتينات DVD الخاصة بالاختراع، يتم إدخال ناقل تعبير ناتج عن عودة الارتباط الجيني يرمز كلاً من السلسلة الثقيلة DVD والسلسلة الخفيفة DVD في خلايا dhfr- CHO عن طريق نقل العدوى الذي يتوسطه فوسفات الكالسيوم. وفي داخل ناقل التعبير الناتج عن عودة الارتباط الجيني، ترتبط جينات سلسلة DVD الثقيلة والخفيفة ارتباطاً فعالاً بالعناصر المنظمة المحسنة لـ CMV / المعززة لـ AdMLP لإدارة مستويات عالية من انتساخ الجينات. يقوم ناقل التعبير الناتج عن عودة الارتباط الجيني كذلك بحمل جين DHFR، مما يسمح بانتقاء خلايا CHO التي تم نقل العدوى إليها بالناقل باستخدام انتقاء/ تضخيم ميثوتركسات. وتتم زراعة الخلايا العائلة المحولة للسماح بالتعبير عن سلاسل DVD الثقيلة والخفيفة ويتم استعادة بروتين DVD وسط الزراعة. ويتم استخدام أساليب الأحياء الجزيئية القياسية في تحضير ناقل التعبير الناتج عن عودة الارتباط الجيني، ونقل العدوى إلى الخلايا العائلة، وانتقاء المحولات، وزراعة الخلايا العائلة واستعادة بروتين DVD من وسط الزراعة. كما يوفر الاختراع كذلك طريقة لتخليق بروتين DVD خاص بالاختراع عن طريق زراعة خلية عائلة خاصة بالاختراع في وسط زراعة مناسب حتى يتم تخليق بروتين DVD الخاص بالاختراع. كما يمكن أن تشتمل الطريقة كذلك على عزل بروتين DVD عن وسط الزراعة.
 ومن السمات الهامة لـ DVD-Ig أنه يمكن إنتاجه وتنقيته بطريقة مشابهة لطريقة جسم مضاد تقليدي. ويؤدي إنتاج DVD-Ig إلى منتج وحيد متجانس ذو نشاط مطلوب مزدوج النوعية، دون أي تعديل للمتوالية للمنطقة الثابتة أو أي تعديل كيميائي من أي نوع. إن الطرق الأخرى سالفة الذكر لإنتاج بروتينات ربط كاملة الطول "ثنائية النوعية"، و"عديدة النوعية"، و"متعددة النوعية وعديدة التكافؤ" لا تؤدي إلى منتج أولي وحيد وإنما تؤدي إلى إنتاج إفرازي داخل الخلية لخليط من بروتينات ربط كاملة الطول غير نشطة، وحيدة النوعية، ومتعددة النوعية، و بروتينات ربط كاملة الطول عديدة التكافؤ مع مواقع ربط مختلفة. وكمثال على ذلك، وبناءاً على التصميم الذي وصفه Miller و Presta (PCT publication WO2001/077342(A1)، هناك 16 توليفة ممكنة من السلاسل الخفيفة والثقيلة. وبالتالي، فمن المتوقع أن نسبة 6.25 فقط من البروتين ستكون في الصورة النشطة المطلوبة، وليس كمنتج رئيسي وحيد أو منتج رئيس أولي وحيد مقارنة بالتوليفات الخمسة عشر الممكنة. ولم يثبت بعد فصل الصور تامة النشاط المطلوبة للبروتينات عن الصور غير النشطة أو النشطة جزئياً للبروتين باستخدام أساليب الكروماتوجراف القياسية، والتي عادة ما تُستخدم في التصنيع على نطاق كبير.
ومن المثير للدهشة، أن تصميم "بروتينات الربط كاملة الطول مزدوجة النوعية وعديدة التكافؤ" الخاصة بالاختراع الحالي يؤدي إلى سلسلة خفيفة لمجال متغير مزدوج وسلسلة ثقيلة لمجال متغير مزدوج حيث تجتمع بشكل أساسي مع "بروتينات الربط كاملة الطول مزدوجة النوعية وعديدة التكافؤ" المطلوبة.
وتعد نسبة 50% على الأقل، و70% على الأقل، و90% على الأقل من جزيئات الجلوبيولين المتجمعة متغيرة المجال المزدوج هي البروتين المطلوب مزدوج النوعية رباعي التكافؤ. وهذه السمة من سمات الاختراع تحسن الفائدة التجارية للاختراع. لذلك، فإن الاختراع الحالي يشتمل على طريقة للتعبير عن سلسلة خفيفة للمجال المتغير المزدوج وسلسلة ثقيلة للمجال المتغير المزدوج في خلية واحدة مما يؤدي إلى منتج رئيسي وحيد من "بروتين ربط كامل الطول مزدوج النوعية رباعي التكافؤ".
يوفر الاختراع الحالي طرقاً للتعبير الوراثي عن سلسلة خفيفة للمجال المتغير المزدوج وسلسلة ثقيلة للمجال المتغير المزدوج في خلية واحدة مما يؤدي إلى "منتج رئيسي" من "بروتين ربط كامل الطول مزدوج النوعية رباعي التكافؤ"، حيث أن "المنتج الرئيسي" يشكل أكثر من 50% من جميع البروتين المتجمع، ويشتمل على سلسلة خفيفة للمجال المتغير المزدوج وسلسلة ثقيلة للمجال المتغير المزدوج.
ويوفر الاختراع الحالي طرقاً للتعبير عن سلسلة خفيفة للمجال المتغير المزدوج وسلسلة ثقيلة للمجال المتغير المزدوج مما يؤدي إلى "منتج رئيسي"وحيد من "بروتين ربط كامل الطول مزدوج النوعية رباعي التكافؤ"، حيث أن "المنتج الرئيسي" يشكل أكثر من 75% من جميع البروتين المتجمع، ويشتمل على سلسلة خفيفة للمجال المتغير المزدوج وسلسلة ثقيلة للمجال المتغير المزدوج.
ويوفر الاختراع الحالي طرقاً للتعبير عن سلسلة خفيفة للمجال المتغير المزدوج وسلسلة ثقيلة للمجال المتغير المزدوج مما يؤدي إلى "منتج رئيسي"وحيد من "بروتين ربط كامل الطول مزدوج النوعية رباعي التكافؤ"، حيث أن "المنتج الرئيسي" يشكل أكثر من 90% من جميع البروتين المتجمع، ويشتمل على سلسلة خفيفة للمجال المتغير المزدوج وسلسلة ثقيلة للمجال المتغير المزدوج.
2. بروتينات الربط DVD المشتقة:
يوفر أحد النماذج بروتين ربط مرقم حيث يتم اشتقاق بروتين الربط الخاص بالاختراع أو ربطه بجزيء وظيفي آخر (مثل ببتيد أو بروتين آخر). فعلى سبيل المثال، يمكن اشتقاق بروتين ربط مرقم خاص بالاختراع عن طريق ربط بروتين ربط خاص بالاختراع (بالاقتران الكيميائي، أو الاندماج الجيني، أو الارتباط غير تساهمي التكافؤ أو غير ذلك) بواحد أو أكثر من الكيانات الجزيئية الأخرى، مثل جسم مضاد آخر (مثل، جسم مضاد ثنائي النوعية أو جسم مضاد ثنائي)، و/ أو عامل يمكن الكشف عنه، و/ أو عامل سام للخلايا، و/ أو عامل صيدلاني، و/ أو بروتين أو ببتيد يمكن أن يتوسط ارتباط بروتين الربط مع جزيء آخر (مثل منطقة لب ستربتاڤيدين أو بطاقة بولي هيستيدين).
إن العوامل المفيدة التي يمكن الكشف عنها التي يمكن باستخدامها اشتقاق بروتين ربط تشمل مركبات متألقة فلورياً. ومن أمثلة العوامل الفلورية التي يمكن الكشف عنها الفلورسين، وأيزو ثيو سيانات فلورسين، ورودامين، وكلوريد 5- داي ميثيل أمين-1- نافثالين سلفونيل، وفيكوإرثرين، وما شابه ذلك. كما يمكن اشتقاق بروتين ربط باستخدام إنزيمات قابلة للرصد، مثل إنزيم فوسفاتاز، والجرجير الحار بيروكسيداز، وجلكوز أوكسيداز وما شابه ذلك. وعند اشتقاق بروتين ربط باستخدام إنزيم قابل للرصد، يتم الكشف عنه بإضافة كواشف إضافية يستخدمها الإنزيم في إنتاج منتج تفاعل يمكن الكشف عنه. فعلى سبيل المثال، عند وجود العامل الذي يمكن الكشف عنه الجرجير الحار بيروكسيداز، فإن إضافة فوق أكسيد الهيدروجين ودايامينو بينزيدين تؤدي إلى منتج تفاعل ملون، يمكن الكشف عنه. كما يمكن اشتقاق بروتين ربط باستخدام بيوتين، والكشف عنه من خلال القياس غير المباشر لربط أڤيدين أو ستربتاڤيدين.
يوفر نموج آخر للاختراع بروتين ربط متبلر وصيغ وتركيبات تشتمل على تلك البلورات. في أحد النماذج، يكون عمر النصف لبروتين الربط المتبلر أكبر في جسم الكائن الحي من نظيره القابل للذوبان لبروتين الربط. وفي نموذج آخر، يحتفظ بروتين الربط بالنشاط الحيوي له بعد التبلر.
ويمكن إنتاج بروتين الربط المتبلر الخاص بالاختراع باستخدام الطرق المعروفة في المجال وكما تم الكشف عنه في الطلب الدولي WO 02072636.
يوفر نموذج آخر للاختراع بروتين ربط مرتبط بالجليكوزيل حيث يشتمل الجسم المضاد أو جزء ربط مولد الضد منه على واحدة أو أكثر من المواقع البنائية للكربوهيدرات. وقد يمر إنتاج بروتين حديث التولد في داخل الكائن الحي بمزيد من المعالجة، تُعرف بالتعديل بعد الترجمة. وبصفة خاصة، قد تتم إضافة وحدات بنائية للسكر (جليكوزيل) إنزيمياً، وهي العملية المعروفة بالارتباط بالجليكوزيل. وتُعرف البروتينات الناتجة التي تحمل سلاسل جانبية قليلة السكريد مرتبطة تساهمياً بالبروتينات المرتبطة بالجليكوزيل أو البروتينات السكرية. والأجسام المضادة هي بروتينات سكرية بها واحدة أو أكثر من الوحدات البنائية الكربوهيدراتية في مجال Fc، وكذلك المجال المتغير.
وللوحدات البنائية الكربوهيدراتية في المجال Fc تأثير مهم على وظيفة المؤثر للمجال Fc، حيث يكون أقل تأثير على ربط مولد الضد أو عمر النصف للجسم المضاد (R. Jefferis، Biotechnol. Prog. 21 (2005)، pp. 11–16). وعلى العكس من ذلك، فإن الارتباط بالجليكوزيل للمجال المتغير قد يؤثر نشاط ربط مولد الضد الخاص بالجسم المضاد. وقد يوثر الارتباط بالجليكوزيل في المجال المتغير سلبياً على ألفة ارتباط مولد الضد، ويحتمل بسبب الإعاقة الفراغية (Co، M.S.، et al.، Mol. Immunol. (1993) 30:1361- 1367)، أو يؤدي إلى زيادة الألفة لمولد الضد (Wallick، S.C.، et al.، Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright، A.، et al.، EMBO J. (1991) 10:2717 2723).
ومن سمات الاختراع الحالي أنه يتعلق بتوليد طفرات مواقع الارتباط بالجليكوزيل التي يتم فيها تطفير موقع الارتباط بالجليكوزيل المرتبط بـ O- أو N- الخاص ببروتين الربط. وبإمكان الشخص صاحب المهارة في المجال توليد تلك الطفرات باستخدام التقنيات القياسية المعروفة جيداً. وتعتبر طفرات مواقع الارتباط بالجليكوزيل التي تحتفظ بالنشاط الحيوي ولكنها تزيد أو تقلل نشاط الارتباط من أهداف الاختراع الحالي.
وفي نموذج آخر، يتم تعديل ارتباط الجسم المضاد الخاص بالاختراع أو جزء ربط مولد الضد بالجليكوزيل. فعلى سبيل المثال، يمكن تحضير جسم مضاد غير مرتبط بالجليكوزيل (أي جسم مضاد يفتقر إلى الارتباط بالجليكوزيل). ويمكن تغيير الارتباط بالجليكوزيل، على سبيل المثال، من أجل زيادة ألفة الجسم المضاد لمولد الضد. ويمكن تحقيق هذه التعديلات الكربوهيدراتية، على سبيل المثال، عن طريق تغيير واحد أو أكثر من مواقع الارتباط بالجليكوزيل داخل متوالية الجسم المضاد. فعلى سبيل المثال، يمكن تحضير واحد أو أكثر من استبدالات الحمض الأميني يؤدي إلى إزالة واحد أو أكثر من مواقع الارتباط بالجليكوزيل ذات المنطقة المغيرة ومن ثم إزالة الارتباط بالجليكوزيل في هذا الموقع. وقد يعمل ذلك الارتباط بالجليكوزيل على زيادة ألفة الجسم المضاد لمولد الضد. وقد تم وصف هذه الطريقة بشيء من التفصيل في منشور PCT للطلب الدولي WO2003016466A2، وبراءتي الاختراع الأمريكيتين رقم 5،714،350 و6،350،861.
وبالإضافة إلى ذلك، أو بديلاً عن ذلك، يمكن تحضير بروتين ربط معدل طبقاً للاختراع له نوع مختلف من الارتباط بالجليكوزيل، مثل جسم مضاد منخفض المعالجة الفوكوزيل به مقادير منخفصة من وحدات الفوكوزيل البنائية (راجع Kanda، Yutaka et al.، Journal of Biotechnology (2007)، 130(3)، 300-310) أوجسم مضاد ذي بنيات GlcNAc تنصيف زائدة. وهذه الأنماط المختلفة من الارتباط بالجليكوزيل قد اثبتت أنها تزيد من قدرة ADCC للأجسام المضادة. ويمكن تحقيق تلك التعديلات الكربوهيدراتية، على سبيل المثال، بالتعبير عن الجسم المضاد في خلية عائلة بآلية معدلة للارتباط بالجليكوزيل. وقد تم وصف خلايا ذات آلية معدلة للارتباط بالجليكوزيل في الفن ويمكن استخدامها كخلايا عائلة يتم فيها التعبير عن الأجسام المضادة الخاصة بالاختراع الحالي وبالتالي إنتاج الجسم المضاد بالارتباط بالجليكوزيل المعدل. راجع، على سبيل المثال، Shields، R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740؛ Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1، وكذلك براءة الاختراع الأوربية EP 1،176،195؛ ومنشورات PCT الطلب الدولي WO 03/035835؛ والطلب الدولي WO 99/54342 80.
يعتمد الارتباط بالجليكوزيل للبروتين على متوالية الحمض الأميني للبروتينات المعنية، وكذلك الخلية العائلة التي يتم فيها التعبير عن البروتين. وقد تقوم الكائنات الحية المختلفة بإنتاج إنزيمات ارتباط بالجليكوزيل مختلفة (مثل إنزيمات جليكوزيل ترانسفيراز وجليكوزيداز)، وتتوفر لها ركائز مختلفة (سكريات نيوكليوتيد). وبسبب تلك العوامل، قد تختلف أنماط ارتباط البروتين بالجليكوزيل، وتركيبات المواقع البنائية للجليكوزيل باختلاف النظام العائل الذي يتم فيه التعبير عن بروتين معين. وقد تشتمل وحدات الجليكوزيل البنائية المفيدة في الاختراع الحالي، على سبيل المثال لا الحصر، الجلوكوز، والجلاكتوز، والمانوز، والفركتوز، و n - أسيتيل جلوكوز أمين وحمض السياليك. وفي أحد النماذج، يشتمل بروتين الربط المرتبط بالجليكوزيل على وحدات بنائية للجليكوزيل بحيث يكون نمط الارتباط بالجليكوزيل بشرياً.
ومن المعروف لأصحاب المهارة في المجال أن اختلاف الارتباط بالجليكوزيل قد يؤدي إلى اختلاف خواص البروتين. فعلى سبيل المثال، فإن كفاءة بروتين علاجي تم إنتاجه في عائل عبارة كائن حي دقيق، مثل الخميرة، والإنتاج المعالج بالجليكوزيل لمسار داخلي المنشأ للخميرة قد تقل مقارنة بنفس البروتين المعبر عنه في خلية لكائن ثديي، مثل سلالة خلايا CHO. كما أن تلك البروتينات السكرية قد تكون مولدة للمناعة في البشر وتتميز بانخفاض عمر النصف في داخل جسم الكائن الحي بعد الإعطاء. وهناك مستقبلات معينة لدى البشر والحيوانات الأخرى قد تتعرف على وحدات بنائية معينة للجليكوزيل وتعزز سرعة تصفية البروتين من مجرى الدم. ومن الآثار العكسية الأخرى التغيرات في طي البروتين، وثباته، والتعرض لإنزيمات البروتياز، والحركة جيئة وذهاباً، والنقل، والتجزئة، والإفراز، والتعرف ببروتينات أخرى أو عوامل أخرى، وتكوين مولدات الضد، أو تكون الحساسية. وبالتالي، قد يختار الممارس بروتينا علاجيا ذا تركيبة معينة ونمط معين للارتباط بالجليكوزيل، مثل تركيبة ونمط الارتباط بالجليكوزيل المطابق، أو على الأقل مشابه، لذلك المنتج في الخلايا البشرية أو في خلايا محددة النوع للحيوان المعني الذي يتم علاجه.
إن التعبير عن البروتينات المرتبطة بالجليكوزيل المختلفة عن بروتينات الخلية العائلة يمكن تحقيقه بالتعديل الوراثي للخلية العائلة للتعبير عن إنزيمات الارتباط بالجليكوزيل مغايرة التكوين. وباستخدام الأساليب المعروفة في المجال يمكن للممارس توليد أجسام مضادة أو أجزاء ربط مولد ضد منه تتميز بالارتباط بالجليكوزيل لبروتين بشري. فعلى سبيل المثال، قد تم تعديل سلالات خميرة وراثياً للتعبير عن إنزيمات ارتباط بالجليكوزيل طبيعية بحيث تتيمز البروتينات المرتبط بالجليكوزيل (البروتينات السكرية) المنتجة في سلالات الخميرة تلك بارتباط بالجليكوزيل للبروتين مطابق لارتباط الخلايا الحيوانية، خاص الخلايا البشري (طلبات براءات الاختراع الأمريكية 20040018590 و20020137134 ومنشور PCT للطلب الدولي WO2005100584 A2).
وبالإضافة إلى بروتينات الربط، فإن الاختراع الحالي يتعلق بأجسام مضادة للترتيب المتفرد (anti-Id) لبروتينات الربط الخاصة بالاختراع. والجسم المضاد anti-Id هو عبارة عن جسم مضاد، يتعرف على محددات فريدة مرتبطة بصفة عامة بموقع ربط مولد الضد لجسم مضاد آخر. ويمكن تحضير anti-Id بتحصين حيوان ببروتين ربط أو منطقة منه تحتوي على CDR. وسوف يتعرف الحيوان المحصن، ويستجيب للمحددات المتفردة للجسم المضاد المستخدم في التحصين وينتج جسم مضاد anti-Id. ومن الواضح أنه يسهل توليد أجسام مضادة للترتيب المتفرد لأثنين أو أكثر من الأجسام المضادة الأصلية المدرجة في جزيء DVD-Ig ؛ وتأكيد دراسات الربط بطرق معروفة جيدًا في المجال (مثل BIAcore، ELISA) للتأكد من أن الأجسام المضادة للترتيب المتفرد الخاص بالترتيب المتفرد لكل جسم مضاد أصلي يتعرف كذلك على الترتيب المتفرد (مثل موقع ربط مولد الضد) في سياق DVD-Ig. توفر الأجسام المضادة للترتيب المتفرد لكل من موقعي ربط مولد الضد أو أكثر لـ DVD-Ig كواشف مثالية لقياس تركيزات DVD-Ig البشري في مصل المريض؛ ويمكن إجراء تجارب قياس تركيز DVD-Ig باستخدام "تصميم ELISA للتجربة البينية" مع جسم مضاد لمناطق ربط مولد ضد أول مغطاة على الطور الصلب (مثل شريحة BIAcore، ولوح ELISA، الخ.)، والمشطوف بمحلول منظم للشطف، والاحتضان بعينة المصل، وخطوة شطف أخرى وأخيراً الاحتضان مع جسم مضاد آخر مضاد للترتيب المتفرد لموقع آخر لربط مولد الضد، ومرقم ذاتياً بإنزيم لقياس تفاعل الربط. في أحد النماذج، بالنسبة لـ DVD-Ig الذي به أكثر من موقعي ربط مختلفين، فإن الأجسام المضادة للترتيب المتفرد لموقعي الربط الخارجيين (الأبعد مكاناً والأقرب من المنطقة الثابتة) لن تساعد فقط في تحديد تركيز DVD-Ig في المصل البشري وإنما ستعمل على توثيق تكامل الجزيء داخل جسم الكائن الحي. كما يمكن استخدام كل جسم مضاد Id "كمولد مناعي" في إحداث استجابة مناعية في حيوان آخر، منتجاً ما يُسمى بالجسم المضاد المضاد لـ Id.
علاوة على ذلك، فسوف يتضح للشخص صاحب المهارة في المجال أنه يمكن التعبير عن البروتين المعني باستخدام مجموعة خلايا عائلة معدلة وراثياً للتعبير عن مختلف إنزيمات الارتباط بالجليكوزيل، بحيث تنتج الخلايا العائلة الأعضاء في المجموعة البروتين المطلوب بمختلف أنماط الارتباط بالجليكوزيل. ثم يقوم الممارس بعد ذلك باختيار وعزل البروتين المطلوب بأنماط معينة جديدة للارتباط بالجليكوزيل. وفي أحد النماذج، يتميز البروتين ذي نمط الارتباط بالجليكوزيل الجديد المنتقى بتحسن أو تعديل الخواص البيولوجية.
3. استخدامات DVD-Ig
مع الوضع في الاعتبار القدرة على ربط اثنين أو أكثر من مولدات الضد فإن بروتينات الربط الخاصة بالاختراع يمكن استخدامها في الكشف عن مولدات الضد (مثلاً في عينة حيوية، مثل المصل أو البلازما)، باستخدام تجارب مناعة ذاتية تقليدية، مثل الاختبار الماص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، أو اختبار المناعة الإشعاعي (RIA)، أو كيمياء الأنسجة المناعية. ويتم بشكل مباشر أو غير مباشر ترقيم DVD-Ig بمادة يمكن الكشف عنها لتسهيل الكشف عن الجسم المضاد المربوط أو غير المربوط. ومن المواد المناسبة التي يمكن الكشف عنها الإنزيمات المختلفة، والمجموعات الاستبدالية، والمواد الفلورية، والمواد المتألقة والمواد المشعة. ومن أمثلة الأنزيمات المناسبة الجرجير الحار بيروكسيداز، وإنزيم الفوسفاتاز القلوي، و*- جالاكتوزيداز، أو أسيتيل كولينستيراز؛ ومن أمثلة معقدات المجموعات الاستبدالية المناسبة ستربتاڤيدين/ بيوتين وأڤيدين/ بيوتين؛ ومن أمثلة المواد الفلورية المناسبة أمبيليفيرون، وفلورسين، وأيزو ثيو سيانات فلورسين، ورودامين، وداي كلورو ترايازينيل أمين فلورسين، وكلوريد دانسيل أو فيسوإريثرين؛ ومن أمثلة المواد المتألقة ليومينول؛ ومن أمثلة المواد المشعة المناسبة 3H، أو 14C، أو 35S، أو 90Y، أو 99Tc، أو 111In، أو 125I، أو 131I، أو 131I، أو 177Lu، أو 166Ho، أو 153Sm.
في أحد النماذج، تكون بروتينات الربط قادرة على معادلة نشاط مولدات الضد سواء في داخل جسم الكائن الحي أو في المعمل. وبالتالي، فمن الممكن استخدام DVD-Igs في تثبيط نشاط مولد الضد، مثلاً، في مزرعة خلايا تحتوي على مولدات ضد، أو في حالات بشرية، أو في حالات ثديية أخرى بها مولدات ضد التي يتفاعل معها بروتين ربط الاختراع الحالي تفاعلاً تبادلياً. وفي نموذج آخر، يوفر الاختراع طريقة لتقليل نشاط مولد الضد في حالة تعاني من مرض أو اضطراب يكون فيه نشاط مولد الضد ضاراً. ويمكن إعطاء بروتين الربط الخاص بالاختراع إلى حالة بشرية لأغراض العلاج.
وكما يتم استخدامه في هذه الوثيقة، فإن مصطلح "اضطراب يكون فيه نشاط مولد الضد ضارا" المقصود به أن يشمل الأمراض أو الاضطرابات الأخرى التي يثبت فيه وجود مولد الضد في الحالة التي تعاني من الاضطراب باعتباره المسئول عن أو يُشك في أنه المسئول عن الفسيولوجيا المرضية للاضطراب أو عامل يساهم في تفاقم الاضطراب. وبالتالي، فإن الاضطراب الذي يكون في نشاط مولد الضد ضاراً هو الاضطراب الذي من المتوقع فيه انخفاض نشاط مولد الضد لتحسين الأعراض و/ أو تقدم الاضطراب. ويمكن إظهار تلك الاضطرابات، على سبيل المثال، بالزيادة في تركيز مولد الضد في مائع حيوي لحالة تعاني من الاضطراب (مثل الزيادة في تركيز مولد الضد في المصل، أو البلازما، أو مائع سائل المفاصل، الخ للحالة المرضية). ومن الأمثلة غير المقيدة للاضطرابات التي يمكن علاجها ببروتينات الربط الخاصة بالاختراع تلك الاضطرابات المذكورة فيما يلي وفي الجزء المتعلق بالتركيبات الصيدلانية للأجسام المضادة الخاصة بالاختراع.
وقد تربط DVD-Igs الخاصة بالاختراع واحد أو أكثر من مولدات الضد. ومن مولدات الضد هذه، على سبيل المثال لا الحصر، الأهداف الواردة في قواعد البيانات التالية،
بروتينات الربط الخاصة بالاختراع، حيث أن قواعد البيانات هذه مدرجة في هذه الوثيقة كمرجع. وقواعد البيانات هذه تشمل ما يلي:
الأهداف العلاجية (http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp)؛
السيتوكينات ومستقبلات السيتوكينات (http://www.cytokinewebfacts.com/ و http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi، و http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html)؛
السيتوكينات (http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html)
مستقبلات السيتوكين و GPCRs (http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html، http://www.gpcr.org/7tm/)؛
المستقبلات الشمية (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp)؛
المستقبلات (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm)؛
أهداف السرطان (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi)؛
البروتينات المفرزة كأهداف محتملة للجسم المضاد (http://spd.cbi.pku.edu.cn/)؛
إنزيم بروتين كيناز (http://spd.cbi.pku.edu.cn/)، و
مرقمات CD البشرية
(http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_الجدول_final_locked.pdf) و (Zola H، 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood، 106:3123-6).
وتعد DVD-Igs مفيدة كعوامل علاجية للإعاقة المتزامنة لاثنين من الأهداف المختلفة لتحسين الكفاءة/ السلامة و/ أو زيادة تغطية المريض. وتلك الأهداف قد تشمل أهداف قابلة للذوبان (TNF) وأهداف مستقبلات سطح الخلية (VEGFR و EGFR). كما يمكن استخدامها في إحداث سمية خلايا معاد توجيها بين خلايا الورم والخلايا T (Her2 و CD3) لعلاج السرطان، أو بين خلية ذاتية التفاعل وخلايا المؤثر لأمراض المناعة الذاتية أو الزرع، أو بين أي خلية مستهدفة وخلية مؤثر لإزالة الخلايا المسببة للمرض في أي مرض.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام DVD-Ig في تحفيز تجمع المستقبلات والتنشيط عند تصميمها لاستهداف نوعين مختلفة من القمم اللاصقة على نفس المستقبل. وقد يكون ذلك فائدة في تصنيع العلاجات المضادة ل GPCR المساعدة والمضادة. وفي هذه الحالية يمكن استخدام DVD-Ig في استهداف نوعين مختلفة من القمم اللاصقة (بما في ذلك القمم اللاصقة على كلا المناطق الحلقية والمجال خارج الخلية) على خلية واحدة لتجميع/ إرسال الإشارات (جزيئات سطحية ثنائية الخلايا) أو إرسال إشارات (على جزيء واحد). كذلك، يمكن تصميم جزيء a DVD-Ig لتحفيز ربط CTLA-4، وإشارة سلبية باستهداف قمتين لاصقتين مختلفتين (أو نسختين من نفس القمة اللاصقة) لمجال CTLA-4 خارج الخلية، مما يؤدي إلى الانخفاض المتحكم فيه للاستجابة المناعية. و CTLA-4 هو هدف مؤيد إكلينيكيا للمعالجة عدد من الاضطرابات المناعية. وتتحكم تفاعلات CTLA-4/B7 سلبياً في تنشيط الخلية T عن طريق إضعاف تقدم دورة الخلية، وإنتاج IL-2، وتكاثر الخلايا T بعد التنشيط، ويمكن لاشتراك CTLA-4 (CD152) أن تخفض بشكل متحكم فيه من تنشيط الخلية T وتعزز إحداث التحمل المناعي. ومع ذلك، فإن إستراتيجية إضعاف تنشيط الخلية T عن طريق إشراك الجسم المضاد المساعد لـ CTLA-4 كانت ناجحة لأن تنشيط CTLA-4 يحتاج إلى الربط. وتفاعل الجزيء الخاص بـ CTLA-4/B7 هو تجارب "ببتدات الربط المتعرجة"، كما يدل على ذلك تحليل البنية البلورية (Stamper 2001 Nature 410:608). ومع ذلك، فإنه ليست ثمة كاشف ربط CTLA-4 من المتوفرين حالياً يتميز بخواص ارتباط، مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة لـ CTLA-4. وقد كانت هناك عدة محاولات لبحث تلك القضية. ففي حالة معينة، تم توليد جسم مضاد وحيد السلسلة مرتبط بعضو خلوي، وقام بتثبيط واضح لرفض الزرع من نفس المصدر في الفئران (Hwang 2002 JI 169:633). وفي حالة منفصلة، تم توليد جسم مضاد وحيد السلسلة مرتبط بسطح APC ولـ CTLA-4 أظهر إضعافاً لاستجابة الخلية T (Griffin 2000 JI 164:4433). وفي كلا الحالتين، تم تحقيق الترابط CTLA-4 عن طريق الأجسام المضادة مرتبط العضو والمتقاربة في أنظمة صناعية. وعلى الرغم من أن تلك التجارب تعطي صحة فكرة الخفض المناعي المتحكم فيه عن طريق تحفيز إرسال الإشارات السلبية لـ CTLA-4، فإن الكواشف المستخدمة في هذه التقارير غير مناسبة للاستخدام العلاجي. ولذلك، قد يتم تحقيق ربط CTLA-4 عن طريق استخدام جزيء DVD-Ig، حيث يستهدف قمتين لاصقتين مختلفتين (أو نسختين من نفس القمة اللاصقة) لمجال CTLA-4 خارج الخلية. والأساس المنطقي لذلك هو أن المسافة التي تفصل موقعي الربط لـ IgG، والتي تتراوح تقريباً بين 150- 170 أنجستروم، كبيرة جداً على الربط الفعال لـ CTLA-4 (30- 50 أنجستروم بين دايمر ثنائي CTLA-4). ومع ذلك فإن المسافة بين موقعي الربط على DVD-Ig (ذراع واحدة) أقصر بكثير، وهي تتراوح أيضاً - 50 أنجستروم، مما يسمح بالربط المناسب لـ CTLA-4.
كذلك، فإن DVD-Ig يمكن أن يستهدف عضوي مختلفين لمعقد مستقبل سطح الخلية (مثل IL-12R ألفا وبيتا). علاوة على ذلك، فإن DVD-Ig يمكنه استهداف CR1 وبروتين/ ممرض لتوجيه تصفية سريعة للبروتين/ الممرض المستهدف القابل للذوبان.
إضافة إلى ذلك، يمكن استخدام، DVD-Igs الخاصة بالاختراع الحالي في توصيل محدد للنسيج (استهداف مرقم نسيجي ووسيط مرضي لتحسين PK المحلي وبالتالي زيادة الكفاءة و/ أو خفض السمية)، مثل التوصيل داخل الخلية (الذي يستهدف مستقبل ذاتي وجزيء بين خلوي)، والتوصيل إلى داخل المخ (الذي يستهدف مستقبل ترانسفرين ووسيط مرض CNS لعبور الحاجز الدموي الدماغي). كما يعمل DVD-Ig كبروتين ناقل لتوصيل مولد ضد إلى موضع معين عن طريق الارتباط بقمة لاصقة غير معادلة لمولد الضد هذا وأيضاً على زيادة عمر نصف مولد الضد. علاوة على ذلك، يمكن تصميم DVD-Ig كي يرتبط فيزيائياً بأجهزة طبية مزروعة داخل المرضى أو يستهدف تلك الأجهزة الطبية (راجع Burke، Sandra E.; Kuntz، Richard E.; Schwartz، Lewis B.، Zotarolimus eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006)، 58(3)، 437-446; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices، Hildebrand، H. F.; Blanchemain، N.; Mayer، G.; Chai، F.; Lefebvre، M.; Boschin، F.، Surface and Coatings Technology (2006)، 200(22-23)، 6318-6324; Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis، Wu، Peng; Grainger، David W.، Biomaterials (2006)، 27(11)، 2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices.، Marques، A. P.; Hunt، J. A.; Reis، Rui L.، Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005)، 377-397). وباختصار، فإن توجيه الأنواع المناسبة من الخلايا إلى موقع الزرع الطبي قد يعزز الشفاء واستعادة وظيفة النسيج الطبيعية. وعلى نحو بديل، فإنه يتم توفير تثبيط الوسائط (على سبيل المثال لا الحصر، السيتوكينات)، التي تنطلق عند زرع الجهاز بـ DVD مقترن أو مستهدف للجهاز. فعلى سبيل المثال، تم استخدام الدعامات لعدة سنوات في علاج القلب بالتدخل الجراحي لإزالة انسداد الشرايين وتحسين تدفق الدم إلى عضلة القلب. ومع ذلك، فقد عرفت الدعامات المعدنية المجردة التقليدية بأنها تسبب معاودة التضيق (إعادة تضيق الشريان في المنطقة التي يتم علاجها) لدى بعض المرضى ويمكن أن تؤدي إلى تجلط الدم. وتم حديثاً وصف الجسم المضاد CD34 الذي يغلف جسم مضاد من نوع الدعامة تم وصفه لكي يتم تقليل معاودة التضيق وخثرات الدم من التكرار عن طريق تحطيم بالخلايا السليفة (EPC) الدوارة بداخل الدم. تكون الخلايا البطانية عبارة عن خلايا تسمح بتسهيل مرور الدم بداخل الأوعية الدموية. تلتصق EPCs بداخل السطح الصلب من الدعامة وتشكل طبقة مناسبة والتي تسهل الالتئام وتمنع معاودة التضيق وتكوين خثرات لدم والتعقيدات المصاحبة لاستخدام الدعامات (Aoji et al. 2005 J Am Coll Cardiol. 45(10):1574-9). وبالإضافة إلى تحسين حالة المرضى الذين تتطلب حالتها وجود دعامة، فإن هناك بعض التعقيدات الخاصة بالمرضى الذي تُجرى لهم جراحات قلبية وعائية. على سبيل المثال، يتم تغليف قناة المجرى الوعائي الاستبدالي (شريان صناعي)  بالأجسام المضادة لـ EPC والتي تفي بحاجة المريض من الأوعية بدلاً من أخذ أوعية من الأرجل أو الأقدام وذلك في عمليات الترقيع الصناعية. وهذه الحالة تعمل على تقليل وقت الجراحة وتقليل زمن التخدير وبالتي تقلل الموت الجراحي نتيجة انسداد الشرايين. تم تصميم DVD-Ig بتلك الطريقة بحيث ترتبط بخلية مرقمة للسطح (مثل CD34) وأيضاً البروتين (أو القمة اللاصقة من أي نوع بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، البروتينات والدهون ومركبات عديد السكريات والتي تم تغليفها على أجهزة الزراعة لكي يتم تسهيل زراعة الخلية. يمكن أن يتم تطبيق تلك الطرق أيضاً على أنواع عمليات لزراعة الطبية الأخرى بشكل عام. وعلى نحو بديل يمكن تغليف DVD-Igs على أجهزة طبية وعند زراعة وإطلاق كل DVDs من الجهاز (أو عند أي حاجة أخرى والتي تتطلب DVD-Ig بما في ذلك تمزق DVD-Ig أو الفترة الطويلة لتواجده والذي يتم تحميله بالفعل بـ DVD-Ig)، يمكن أن يتم إعادة تحميل الجهاز عن طريق الإعطاء المجموعي لـ DVD-Ig إلى المريض، حيث DVD-Ig قد تم تصميمه لكي يرتبط بالمستهدف محل الاهتمام (سيتوكين ومرقم سطح الخلية (مثل CD34 ) إلخ.) مع مجموعة واحدة من مواضع الربط بالمستهدف الذي يتم تغليفه على الجهاز (الذي يشتمل على بروتين أو قمة لاصقة من أي نوع بما في ذلك، ليس على سبيل الحصر، الدهون ومركبات البولي سكاريد والبوليمرات) مع المركبات الأخرى. تكون هذه التقنية لها مزايا تتمثل في مد فترة الفعالية الخاصة بالأجزاء التي تتم زراعتها.