كائنات حية دقيقة مُختارة أو مُوجهة لإنتاج المنتجات المعنية التي أساسها الكربون
تشتمل الكائنات الحية الدقيقة على أنواع جرثومية بدائية النواة وحقيقية النواة من حقول Archaea, Bacteria و Eucarya, ويشتمل الأخير على خميرة وفطريات خيطية, أوليات, طحالب, أو الأَوَّلاَنِيَّاتُ العُلْيا. ويستخدم المصطلح "خلايا جرثومية" و "جراثيم" بشكل متبادل مع مصطلح كائنات حية دقيقة.
ويمكن أن تتحول أشكال مختلفة من الكائنات الحية العائلة لإنتاج المنتج المعني. وتشتمل الكائنات الحية ذاتية التغذية الضوئية على نباتات وطحالب حقيقية النواة, وكذلك على بكتيريا زرقاء بدائية النواة, بكتيريا خضراء كبريتية, بكتيريا خضراء غير كبريتية, بكتيريا أرجوانية كبريتية, وبكتيريا أرجوانية غير كبريتية.
وقد تكون الخلايا العائــلة عبارة عن خلايا بكتيريا سالبة الغرام أو خلايا بكتيريا موجبـة الغرام. وقـد تكـون الخلايا العائـلة سالبة الغرام وفقاً للاختراع, على سبيـل المثال, Gluconobacter, Rhizobium, Bradyrhizobium, Alcaligenes, Rhodobacter, Rhodococcus, Azospirillum, Rhodospirillum, Sphingomonas, Burkholderia, Desuifomonas, Geospirillum, Succinomonas, Aeromonas, Shewanella, Halochromatium, Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, ymomonas Zymobacter, أو Acetobacter. ويمكن أن تكون الخلايا العائلة موجبة الغرام وقفاً للاختراع, على سبيل المثال, Fibrobacter, Acidobacter, Bacteroides, Sphingobacterium, Actinomyces, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Propionibacterium, Bifidobacterium, Bacillus, Geobacillus, Paenibacillus, Sulfobacillus, Clostridium, Anaerobacter, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, Lactococcus, Thermobifida, Cellulomonas, أو Sarcina.
ويتضمن الاختراع أيضاً الكائنات الحية الأليفة للظروف القاسية (اكستريموفيلز) بصفتها كائنات حية مناسبة. وتكون الكئنات الحية هذه قادرة على تحمل عوامل بيئية مختلفة مثل درجة الحرارة, الإشعاع, الضغط, الجاذبية الأرضية, الخواء, الجفاف, الملوحة, درجة الحموضة, توتر الأكسجين, والمواد الكيميائية. وتشتمل أيضاً على كائنات حية أليفة للحرارة المفرطة والتي تنمو عند درجة الحرارة تبلغ 80°م أو أعلى مثل Pyrolobus fumarii؛ كائنات حية أليفة للحرارة, والتي تنمو في درجة حرارة تتراوح من 60 إلى 80°م مثل Synechococcus lividis؛ كائنات حية أليفة للحرارة المعتدلة, والتي تنمو عند درجة حرارة تتراوح من 15 على 60°م وكائنات حية أليفة للبرودة, والتي تنمو عند درجة حرارة أقل من 15°م مثل Psychrobacter وبعض الحشرات. وتشتمل الكائنات الحية التي تتحمل الإشعاع على Deinococcus radiodurans. وتشتمل الكائنات الحية التي تتحمل الضغط على كائنات حية أليفة للضغط أو للضغط العالي, والتي تكون قادرة على تحمل قيم ضغط تبلغ 130 ميغاباسكال. ويتضمن الاختراع أيضاً الكائنات الحية التي تقاوم الجاذبية المفرطة (على سبيل المثال > 1 غم), الجاذبية المتدنية (على سبيل المثال < 1 غم). وتشتمل الكائنات الحية القادرة على تحمل الخواء على كائنات بطيئة الحركة, حشرات, جراثيم وبذور. وتشتمل الكائنات الحية القادرة على تحمل الجفاف والحيوية منزوعة الماء على الكائنات الحية الأليفة للجفاف مثل Artemia salina؛ الدودة المدورة, الجراثيم, الفطر والأشنات. وتشتمل الكائنات الحية القادرة على تحمل الملح على كائنات حية أليفة للملح (على سبيل المثال NaCl بتركيز من 2 إلى 5 جزيئي غرامي) Halobacteriacea و Dunaliella salina. وتشتمل المواد القادرة على تحمل درجة الحموضة على الكائنات الأليفة للقلويات مثل Natronobacterium, Bacillus firmus OF4, Spirulina spp. (على سبيل المثال, pH>9) وكائنات أليفة للحمض مثل Cyanidium caldarium, Ferroplasma sp. (على سبيل المثال, pH منخفض). ويتضمن الاختراع أيضاً الكائنات اللاهوائية, والتي لا تكون قادرة على تحمل O2 مثل Methanococcus jannaschii؛ الكائنات الأليفة للهواء القليل, والتي تكون قادرة على تحمل القليل من O2 مثل Clostridium والكائنات الحية الهوائية, والتي تحتاج إلى O2. وتشتمل الكائنات الحية القادرة على تحمل الغاز, والتي تكون قادرة على تحمل CO2 نقي على Cyanidium caldarium وتشتمل الكائنات الحية الدقيقة القادرة على تحمل الفلز على متحملات الفلز مثل Ferroplasma acidarmanus (على سبيل المثال, Cu, As, Cd, Zn), Ralstonia sp. CH34 (على سبيل المثال, Zn, Co, Cd, Hg, Pb). انظر المرجع Gross, Michael. Life on the Edge: Amazing Creatures Thriving in Extreme Environments. New York: Plenum (1998) والمرجع Seckbach, J. "Search for Life in the Universe with Terrestrial Microbes Which Thrive Under Extreme Conditions." In Cristiano Batalli Cosmovici, Stuart Bowyer والمرجع Dan Wertheimer, eds., Astronomical and Biochemical Origins and the Search for Life in the Universe, p. 511. Milan: Editrice Compositori (1997).
وتشتمل النباتات على سبيل المثال لا الحصر على الأنواع التالية: Arabidopsis, Beta, Glycine, Jatropha, Miscanthus, Panicum, Phalaris, Populus, Saccharum, Salix, Simmondsia, و Zea.
وتشتمل الطحالب والبكتيريا الزرقاء على سبيل المثال لا الحصر على الأنواع التالية: Acanthoceras, Acanthococcus, Acaryochloris, Achnanthes, Achnanthidium, Actinastrum, Actinochloris,Xenococcus, Zygnema, Zygnemopsis, و Zygonium.
وتشمل البكتيريا الخضراء غير الكبريتية، بدون حصر، الأنواع التالية: Chloroflexus، Chloronema، Oscillochloris، Heliothrix، Herpetosiphon، Roseiflexus، و Thermomicrobium.
وتشمل البكتيريا الخضراء الكبريتية، بدون حصر، الأنواع التالية: Chlorobium، Clathrochloris، و Prosthecochloris.
وتشمل البكتيريا الأرجوانية الكبريتية، بدون حصر، الأنواع التالية: Allochromatium، Chromatium، Halochromatium، Isochromatium، Marichromatium، Rhodovulum، Thermochromatium، Thiocapsa، Thiorhodococcus، و Thiocystis.
وتشمل البكتيريا الأرجوانية غير الكبريتية، بدون حصر، الأنواع التالية: Phaeospirillum، Rhodobaca، Rhodobacter، Rhodomicrobium، Rhodopila، Rhodopseudomonas، Rhodothalassium، Rhodospirillum، Rodovibrio، و Roseospira.
وتشتمل البكتيريا الهوائية جمادية التغذية، بدون حصر، على بكتيريا النترجة مثل نوع Nitrobacteraceae، نوع Nitrobacter، نوع Nitrospina، نوع Nitrococcus، نوع Nitrospira، نوع Nitrosomonas، نوع Nitrosococcus، نوع Nitrosospira، نوع Nitrosolobus، نوع Nitrosovibrio؛ بكتيريا كبريتية لا لون لها مثل نوع Thiovulum، نوع Thiobacillus، نوع Thiomicrospira، نوع Thiosphaera، نوع Thermothrix؛ بكتيريا هيدروجينية جمادية التغذية إجبارياً مثل نوع Hydrogenobacter، بكتيريا أكسدة و/أو ترسيب الحديد والمنغنيز مثل نوع Siderococcus، والبكتيريا المغناطيسية مثل نوع Aquaspirillum.
وتشتمل العتائق، بدون حصر، عتائق مولدة للميثان مثل نوع Methanobacterium، نوع Methanobrevibacter، نوع Methanothermus، نوع Methanococcus، نوع Methanomicrobium، نوع Methanospirillum، نوع Methanogenium، نوع Methanosarcina، نوع Methanolobus، نوع Methanothrix، نوع Methanococcoides، نوع Methanoplanus؛ مستقلبات كبريتية أليفة للحرارة بشكل مفرط مثل نوع Thermoproteus، نوع Pyrodictium، نوع Sulfolobus، نوع Acidianus وكائنات حية دقيقة أخرى مثل Bacillus subtilis، Saccharomyces cerevisiae، نوع Streptomyces، نوع Ralstonia، نوع Rhodococcus، نوع Corynebacteria، نوع Brevibacteria، نوع Mycobacteria، وخميرة زيتية.
وتتطلب عملية تحويل التركيب الضوئي المفرط إلى تعديل جيني شامل؛ وبالتالي, في التجسيدات المفضلة, يمكن تحويل الكائنات الحية ذاتية التغذية الضوئية الأبوية باستخدام DNA خارجي المنشأ.
وتشمل الكائنات الحية لتحويل التركيب الضوئي المفرط: Arabidopsis thaliana، Panicum virgatum، Miscanthus giganteus، و Zea mays (نباتات)، Botryococcus braunii، Chlamydomonas reinhardtii و Dunaliela salina (طحالب)، نوع Synechococcus PCC 7002، نوع Synechococcus PCC 7942، نوع Synechocystis PCC 6803، و Thermosynechococcus elongates BP-1 ((بكتيريا زرقاء)، Chlorobium tepidum (بكتيريا كبريتية خضراء), Chloroflexus auranticus (بكتيريا غير كبريتية خضراء), Chromatium tepidum، و Chromatium vinosum (بكتيريا كبريتية أرجوانية), Rhodospirillum rubrum، Rhodobacter capsulatus، و Rhodopseudomonas palusris (بكتيريا غير كبريتية أرجوانية).
وتشمل كائنات حية أخرى مناسبة خلايا اصطناعية أو خلايا منتجة بواسطة مجينات اصطناعية كما وصف في نشرة براءة الاختراع الأمريكية رقم 0264688/2007 باسم فينتر ومعاونيه, وأنظمة تشبه الخلايا أو خلايا اصطناعية كما وصف في نشرة براءة الاختراع الأمريكية رقم 0269862/2007 باسم جلاس ومعاونيه.
وتشمل كائنات حية أخرى مناسبة كائنات حية دقيقة يمكن هندستها لتثبيت بكتيريا ثاني أكسيد الكربون مثل Escherichia coli، Acetobacter aceti,، Bacillus subtilis، خمائر وفطريات مثل Clostridium ljungdahlii، Clostridium thermocellum، Penicillium chrysogenum، Pichia pastoris، Saccharomyces cerevisiae، Schizosaccharomyces pombe، Pseudomonas fluorescens، أو Zymomonas mobilis.
إن الفكرة الرئيسية العامة في اختيار أو هندسة الكائنات الحية المناسبة تتمثل في التثبيت ذاتي التغذية لـِ CO2 للحصول على منتجات. وهذا يشمل التركيب الضوئي وتوليد الميثان. وتشمل أيضاً توليد الأسيتون, الذي يتضمن الأنواع الثلاثة من تثبيت CO2؛ دورة كالفن, ومسار أسيتيل-التميم A, و TCA المختزل. وتستطيع كل المجموعات الرئيسية من بدائيات النواة أن تستخدم ثاني أكسيد الكربون كمصدر وحيد لكربون الخلية (ذاتية التغذية). وتختلف مسارات تثبيت CO2 بين المجموعات, ولا يوجد نمط توزيع واضح للمسارات الأربع ذاتية التغذية المعروفة التي تم تقديمها. انظر المرجع Fuchs, G. 1989. Alternative pathways of autotrophic CO2 fixation, p. 365‑382. وفي H. G. Schlegel, and B. Bowien (ed.), Autotrophic bacteria. Springer‑Verlag, Berlin, Germany. وتمثل دورة فسفات البِنتوز المختزل (دورة كالفن-باشام-بنسن) مسار تثبيت CO2 في العديد من البكتيريا ذاتية التغذية الهوائية, على سبيل المثال البكتيريا الزرقاء.
طرق لاستنبات خلايا عائل
تزود ظروف تخمير ملائمة لاستنبات خلايا العائل. وفي أحد تجسيدات الاختراع، يستخدم وسط JB 2.1، كما وصف في طلب براءة الاختراع الأمريكية وفقاً لمعاهدة التعاون في مجال براءات الاختراع رقم 006516/2009، أدمجت هنا بالكامل كمرجع، كوسط ملائم لاستنبات خلايا العائل. وفي تجسيد آخر، يمكن إضافة مركبات إضافية في وسط JB 2.1، إزالتها، أو تغييرها لتزويد التأثيرات المرغوبة على المستنبت. ويمكن استخدام وسط بديل لاستنبات خلايا العائل لتوفير الظروف المثلى للسلالة وللتأثير المرغوب. وهذه الأوساط البديلة معروفة جيداً في التقنية. وفي أحد التجسيدات، يشتمل الوسط بشكل إضافي على طور غير قطبي في نظام ثنائي الطور.
وفي أحد تجسيدات مستنبت خلية العائل، يتم استنبات الخلايا في نظام ثنائي الطور. وفي تجسيد آخر للنظام ثنائي الطور، يتألف الطور القطبي من وسط النمو لخلية العائل، ويتألف الطور غير القطبي من طور من جزيئات غير أليفة للماء. ويمكن أن تكون الجزئيات غير الأليفة للماء عبارة عن هيدروكربونات. وفي أحد التجسيدات، يكون الطور غير القطبي مفيد لاستخلاص أو جمع أو مراكمة منتج معني أساسه الكربون. ويمكن أن يكون المنتج الذي أساسه الكربون المعني عبارة عن هيدروكربون. وفي أحد التجسيدات، يتألف الطور غير القطبي من هيدروكربونات. وفي تجسيد آخر، يتألف الطور غير القطبي من منتج أساسه كربون معني. وفي تجسيد آخر أيضاً، يشتمل الطور غير القطبي على هيدروكربون يكون عبارة عن منتج أساسه كربون معني.
وفي تجسيد آخر لمستنبت خلية العائل، يتم استنبات الخلايا في نظام ثنائي الطور يشتمل على دكسترين حلقي واحد على الأقل. وفي أحد التجسيدات، يكون الدكسترين الحلقي عبارة عن α-، β-، أو γ-دكسترين حلقي. وفي تجسيد آخر، يتم تعديل الدكسترين الحلقي كيميائياً. وفي تجسيد آخر أيضاً، إن وجود الدكسترين الحلقي يزيد من احتمالية نقل منتج أساسه الكربون معني ناتج عن طريق خلية عائل إلى الطور غير القطبي بعد إطلاق المنتج الذي أساسه الكربون المعني عن طريق خلية العائل. وفي تجسيد آخر أيضاً، إن وجود الدكسترين الحلقي يزيد من احتمالية نقل هيدروكربون ناتج عن طريق خلية عائل إلى الطور غير القطبي بعد إطلاق الهيدروكربون عن طريق خلية العائل. وفي تجسيد آخر أيضاً، ينقل جزيء الدكسترين الحلقي إلى الطور غير القطبي هيدروكربون ناتج عن طريق بكتيريا زرقاء.
وتعرف جيداً في التقنية مثبتات الكدورة كشكل من مستنبت متصل تزود من خلاله أوساط ومواد مغذية على أساس غير متقطع وتتيح الانتشار غير المتوقف لمجموعات الخلايا العائلة. وتتيح مثبتات الكدورة للمستخدم تحديد معلومات عن الانتشار الكلي للخلايا والإنتاجية في الحالة المستقرة لمنتج نهائي ناتج حيوياً محدد مثل، زمن ازدواج خلايا العائل، معدلات إنتاج للكتلة الحيوية محددة مؤقتاً لكثافة مجموعة خلايا عائل محددة، تأثيرات كثافة مجموعة خلايا عائل محددة مؤقتاً على تحويل الركيزة، وصافي الإنتاجية لقيام خلية عائل بتحويل ركيزة من جزيئات أصلية إلى منتجات أساسها كربون معنية. ويمكن تصميم مثبتتات الكدورة لمراقبة تجزئة منتجات تحويل الركيزة إلى الطور غير القطبي أو إلى الحالة السائلة أو الغازية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تقييم كمي على نحو دقيق لصافي الإنتاجية لمنتج أساسه الكربون معني بسبب المستوى المضبوط للتحكم الذي يمتلكه المتمرس في التقنية في عملية تستخدم فيها مثبتات الكدورة. وهذه الأنواع من المعلومات مفيدة لتقييم الفعاليات المحللة والصافية لخلية عائلة مهندسة وراثياً لإنتاج منتج أساسه الكربون معني.
وفي أحد التجسيدات، يتم استنبات خطوط خلايا عائل متطابقة مختلفة فقط من ناحية الحمض النووي وتسلسل متعدد الببتيد المعبر عنه لإنزيم متناظر في مثبت كدورة منتظم الوسط لتحديد أعلى فعالية للخلية ككل للمنتج الذي أساسه الكربون المرغوب المعني.
وفي تجسيد آخر، يتم استنبات خطوط خلايا عائل متماثلة فقط من ناحية الحمض النووي وسياق متعدد ببتيد معبر عنه لإنزيم متناظر في مستنبت دفعي أو مثبت كدورة في أوساط متفاوتة (مثل، تعرض لدرجة حرارة، درجة حموضة، ملوحة، مادة مغذية) لتحديد أعلى فعالية للخلية ككل للمنتج الذي أساسه الكربون المرغوب المعني.
دكسترين حلقي
في أحد تجسيدات الاختراع، يتكون جزيء الدكسترين الحلقي من 6 وحدات غلوكوبيرانوز (α-دكسترين حلقي)، 7 وحدات غلوكوبيرانوز (β-دكسترين حلقي)، أو 8 وحدات غلوكوبيرانوز (γ-دكسترين حلقي). وفي تجسيد آخر، يتكون جزيء الدكسترين الحلقي من خمسة وحدات غلوكوبيرانوز أو أكثر، وفي تجسيد آخر أيضاً، يكون جزيء الدكسترين الحلقي في خليط متجانس من جزيئات دكسترين حلقي. وفي تجسيد بديل، يكون جزيء الدكسترين الحلقي في خليط متغاير من جزيئات دكسترين حلقي. وفي تجسيد آخر، يتكون جزيء الدكسترين الحلقي من خمسة وحدات α-D-غلوكوبيرانوسيد أو أكثر مرتبطة بواسطة رابطة 1→4 غليكوزيدية.
وفي جزئيات الدكسترين الحلقي، يكون لكل وحدة غلوكوبيرانوز ثلاثة مجموعات هيدروكسيل حرة. ويمكن تعديل مجموعة واحدة أو أكثر من مجموعات الهيدروكسيل هذه عن طريق الاستعاضة عن ذرة هيدروجين أو مجموعة الهيدروكسيل بتشكيلة متنوعة من المجموعات البديلة، بما فيها، مجموعات ألكيل، هيدروكسي ألكيل، كربوكسي ألكيل، أمينو، ثيو، توسيل، غلوكوسيل، ومالتوسيل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحضير إيثرات، إسترات، مشتقات أنهيدرو، مشتقات منزوعة الأكسجين، حمضية، قاعدية عن طريق تفاعلات كيميائية أو إنزيمية. وفي أحد التجسيدات، يتم إضافة المثيل إلى جزيء الدكسترين الحلقي. وفي تجسيد آخر، يضاف 2-هيدروكسي بروبيل إلى جزيء الدكسترين الحلقي.
ويمكن إجراء تعديلات إضافية لتحسين قابلية مشتقة ذوبان الدكسترين الحلقي. ويمكن لعملية التعديل أن تحسن التركيبة و/أو الارتباط بين الدكسترين الحلقي وجزيء نزيل مرغوب، أو تثبيت على نحو محتمل الجزيء النزيل المرغوب، أو يمكن أن تقلل على نحو إضافي تفاعلية وقابلية حركة الجزيء النزيل المرغوب. ويمكن أن تتيح تعديلات أخرى على الدكسترين الحلقي تشكل بنيات تحتوي على دكسترين حلقي أو بوليمرات ثابتة. كما يمكن إضافة مجموعات خاصة، على الأرجح حفزية، إلى أو بالقرب من موقع ارتباط الجزيء المستهدف.
والأمثلة التالية هي لأغراض التوضيح ولا يقصد منها تحديد نطاق الاختراع.