استخلاص جزيئات أساسها الكربون من خلية عائلة
مجال الاختراع
يتعلق الكشف الراهن بتراكيب وعمليات استخلاص كيميائية، وأكثر تحديداً، يتعلق الاختراع باستخدام جزيئات دكسترين حلقية لاستخلاص هيدروكربونات مثل ألكانات، ألكينات، وإسترات لأحماض دهنية من خلايا عائلة منتجة ونقلها إلى طبقة مذيب في نظام ثنائي الطور.
خلفية الاختراع
تتلقى إزالة الجزيئات حيوية المنشأ المنتجة بواسطة مستنبت للخلايا في وسط استنبات للخلايا اهتماماً خاصاً من البحوث في مجال إنتاج الوقود الحيوي من كائنات حية عائلة. وثمة حاجة لعمليات جديدة لاستخلاص منتجات أساسها الكربون معينة بشكل فعال من مستنبت للخلايا العائلة قادر على إنتاج منتجات أساسها الكربون معينة.
ومركبات الدكسترين الحلقية هي عبارة عن مركبات سكريد قليلة الحدود حلقية مؤلفة من وحدات ألفا-غلوكوز مرتبطة عند المواقع (1، 4). وتوجد عادة في صورة حلقات مكونة من 6 أعضاء (مركبات α-دكسترين حلقية)، 7 أعضاء (مركبات β-دكسترين حلقية) أو 8 أعضاء (مركبات β-دكسترين حلقية)، ومع ذلك، توجد العديد من الأشكال البديلة، بما في ذلك حلقات مكونة من 32 وحدة مميَّزة جيداً، وتعرف أيضاً مركبات سكريد قليلة الحدود حلقية تشتمل على 150 عضو على الأقل. وحضِّرت العديد من مشتقات الدكسترين الحلقي، بما في ذلك أشكال أشكال ممثيلة، يمكن إنتاجها عن طريق مفاعلة الدكسترين الحلقي الأصلي مع هاليدات مثيل. ولمركبات الدكسترين الحلقية خصائص أمفيفاتية حيث تتضمن جزء خارجي محب للماء وجزء داخلي كاره للماء، مما يتيح لها إذابة الجزيئات غير القطبية في أوساط مائية. وثمة عدة استخدامات لها، وتستخدم على نطاق واسع في الصناعات الصيدلانية، الغذائية والتجميلية؛ انظر، على سبيل المثال، المرجع Del Valle, E.M.M., Process Biochemistry, 39:1033-1046 (2004).
وتتيح مركبات الدكسترين الحلقية ومشتقاتها موازنة سريعة للكولسترول بين الحويصلات (Leventis, R., et al., Biophysical Journal, 81:2257-2267 (2001))، ويمكنها أيضاً إزالة الكولسترول من خلايا رغوية بلعمية (Atger, V.M., et al., J. Clin. Invest., 99:773-780 (1997)). وتؤدي إضافة مركبات الدكسترين الحلقية إلى مستنبتات بكتيرية محللة للهيدروكربون إلى زيادة معدَّل تقويض الألكان عن طريق زيادة ذائبية الألكانات في الأوساط المائية (Sivaraman, C., et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology, 26:227-232 (2010)). ويكفل الاختراع الموصوف في هذه المواصفة أن إضافة مركبات الدكسترين الحلقية إلى مستنبتات تحتوي على الهيدروكربون (مثلاً، وقود ديزل، وجزيئات مصدرية ذات صلة) تنتج سلالات من خلايا عائلة، مثلاً، البكتيريا الزرقاء (البكتيريا السيانية)، مما يتيح استخلاص هيدروكربونات نموذجية، مثلاً ألكانات، ألكينات، و/أو إسترات لأحماض دهنية ونقل هذه الجزيئات الكارهة للماء إلى طبقة المذيب في نظام ثنائي الطور.
الكشف عن الاختراع
يتعلق الاختراع الراهن بطرق وتراكيب تستخدم لاستخلاص جزيئات أساسها الكربون من خلية عائلة. ويمكن استخلاص جزيئات أساسها كربون مختلفة من خلية عائلة ونقلها إلى طبقة مذيب في نظام ثنائي الطور باستخدام جزيء دكسترين حلقي للمساعدة في النقل بين الخلية وطبقة المذيب.
وبالتالي، يزود الاختراع طريقة لاستخلاص جزيء أساسه الكربون من خلية عائلة تتضمن ملامسة خلية عائلة مع محلول بحيث يشتمل المحلول على دكسترين حلقي واحد على الأقل. وفي أحد تجسيدات الاختراع، تعتبر الخلية العائلة خلية بدائية النواة.
وفي أحد أوجه الاختراع الراهن، يكون الجزيء الذي أساسه كربون غير قطبي. وفي وجه آخر للاختراع الراهن، يكون الجزيء الذي أساسه كربون عبارة عن جزيء وقود أليف الشحم. وفي أحد تجسيدات الاختراع الراهن، يكون الجزيء الذي أساسه كربون عبارة عن هيدروكربون طويل السلسلة. ويمكن أن يكون الهيدروكربون طويل السلسلة وفقاً لهذا التجسيد عبارة عن ألكان طويل السلسلة وقد يكون عبارة عن ألكين طويل السلسلة. وفي تجسيد بديل، يكون الألكان طويل السلسلة عبارة عن خماسي ديكان، سداسي ديكان، أو سباعي ديكان.
وفي تجسيد آخر للاختراع الراهن، يكون الجزيء الذي أساسه كربون عبارة عن ألكان، ألكين، أو إستر لحمض دهني. وفي تجسيد بديل للاختراع، يكون الجزيء الذي أساسه كربون عبارة عن 1-نوناديكين، خماسي ديكان، سداسي ديكان، سباعي ديكان أو إستر بيوتيل لحمض دهني. وفي بعض الأوجه، قد يكون إستر بيوتيل الحمض الدهني عبارة عن ميريستات بيوتيل، بلميتات بيوتيل، سباعي ديكانوات بيوتيل، أوليئات بيوتيل، أو ستيارات بيوتيل.
وفي أحد الأوجه، تكون الخلية بدائية النواة عبارة عن كائن حي ضوئي التخليق. وفي وجه آخر، يكون الكائن الحي ضوئي التخليق عبارة عن بكتيريا زرقاء. وفي أحد التجسيدات، تتضمن الخلية بدائية النواة تعديل جيني واحد على الأقل. وفي تجسيد آخر، يخفض التعديل الجيني طبقة S في الخلية بدائية النواة. وفي تجسيد بديل، يخفض التعديل الجيني التركيب النسبي للكنان السكري في الخلية بدائية النواة.
وفي بعض الأوجه، تحتوي الخلية بدائية النواة على مسار نقل معبَّر عنه بشكل مغاير واحد أو أكثر. وتزوَّد أيضاً أوجه تشتمل فيها الخلية بدائية النواة على بروتين واحد على الأقل معبَّر عنه بشكل مفرط. وفي أحد التجسيدات، تعتبر هذه البروتينات المعبَّر عنها بشكل مفرط جزءاً من مسارات النقل المعبَّر عنها بشكل مغاير. وفي تجسيد آخر، يشارك المكون البروتيني في مسار النقل المعبَّر عنه بشكل مغاير في نقل الجزيئات التي أساسها كربون إلى الغشاء الخارجي للخلية بدائية النواة. وفي وجه إضافي، يتم تعديل التعبير عن الجين الذي يشفر المكون البروتيني. وفي وجه آخر، تتم زيادة التعبير عن الجين الذي يشفر المكون البروتيني.
وفي وجه آخر، يزود الاختراع الراهن أيضاً نقل لجزيء محب للماء واحد على الأقل من خلية بدائية النواة إلى طبقة مذيب. وفي أحد التجسيدات، تستخدم الطريقة وسط استنبات للخلايا ثنائي الطور. وفي أحد الأوجه، يشتمل وسط استنبات الخلايا ثنائي الطور على طور غير قطبي يتألف من دوديكان. وفي وجه آخر، يشتمل وسط استنبات الخلايا ثنائي الطور على طور غير قطبي يتألف من هيدروكربون، حيث يتراوح عدد ذرات الكربون في الهيدروكربون من 6 إلى 30. وفي تجسيد آخر، يشتمل الوسط على مادة مضادة للتأكسد واحدة على الأقل. وفي تجسيد آخر، تشتمل المادة المضادة للتأكسد على هيدروكسي تولوين معالج بالبيوتيل. وفي تجسيد آخر أيضاً، يشتمل الوسط على معيار داخلي واحد على الأقل. وفي تجسيد آخر، يشتمل المعيار الداخلي على هبتاكوسان.
وفي أحد التجسيدات، يمكن أن يكون الدكسترين الحلقي وفقاً للاختراع الراهن عبارة عن α-دكسترين حلقي، β-دكسترين حلقي، أو γ-دكسترين حلقي. وفي بعض التجسيدات، يشتمل الدكسترين الحلقي على تعديل. وفي تجسيد آخر، يعالج الدكسترين الحلقي بالمثيل. وفي تجسيد آخر، يكون الدكسترين الحلقي عبارة عن مثيل-β-دكسترين حلقي.
وفي تجسيد آخر، يزود الاختراع طريقة يزيد فيها الدكسترين الحلقي من نقل المنتج الذي أساسه كربون إلى الطور غير القطبي في محلول ثنائي الطور، مثلاً، وسط استنبات للخلايا. وفي أحد التجسيدات، تتم إزالة المنتجات التي أساسها كربون من المحلول. وفي تجسيد آخر، يزود الاختراع طريقة لاستنبات خلية بدائية النواة لإنتاج جزيء أساسه كربون في خطوات تتضمن: استنبات الخلية بدائية النواة في وسط ثنائي الطور يشتمل على دكسترين حلقي واحد على الأقل، حيث تنتج الخلية بدائية النواة الجزيء الذي أساسه الكربون؛ وجمع الجزيء الذي أساسه كربون من الطور غير القطبي في الوسط ثنائي الطور. وفي وجه آخر للاختراع، يتم تنفيذ خطوات استنبات الخلايا بدائية النواة في وسط ثنائي الطور يشتمل على دكسترين حلقي واحد على الأقل وجمع الجزيء الذي أساسه كربون من الطور غير القطبي بشكل متكرر. ويتيح هذا الوجه للاختراع، استنبات متواصل للخلايا بدائية النواة وبعد ذلك إنتاج وجمع الجزيء الذي أساسه كربون المنتج بواسطة الخلايا بدائية النواة بشكل متكرر.
ويزود الاختراع الراهن أيضاً تركيب مفيد لاستخلاص الجزيء الذي أساسه كربون من خلية عائلة، بحيث يشتمل التركيب على خلية بدائية النواة ووسط ثنائي الطور يحتوي على دكسترين حلقي واحد على الأقل. وفي تجسيد آخر، يتم عموماً تعديل الخلية بدائية النواة في التركيب. وفي تجسيد آخر، تنتج الخلية بدائية النواة جزيء أساسه كربون. وفي تجسيد آخر، يكون الجزيء الذي أساسه كربون عبارة عن ألكان، ألكين أو إستر لحمض دهني.
وصف مختصر للرسوم
الشكل 1 : يمثل رسماً بيانياً يوضح تراكم مركبات الألكان في غطاء الدوديكان للمستنبتات JCC1469، حيث CD = دكسترين حلقي، وMe = مثيل.
الشكل 2 : يمثل مجموعة من الرسوم البيانية التي توضح محتوى الألكان المرافق لخلية JCC1469 مع الزمن، حيث (أ) مستنبتات تحتوي على α-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، (ب) مستنبتات تحتوي على β-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، (جـ) مستنبتات تحتوي على Me-β-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، وحيث CD = دكسترين حلقي DD = دوديكان، Me = مثيل.
الشكل 3 : يوضح كثافات الخلايا في المستنبت JCC1469 بعد إضافة مركبات دكسترين حلقي و/أو دوديكان، حيث (أ) مستنبتات تحتوي على α-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، (ب) مستنبتات تحتوي على β-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، (جـ) مستنبتات تحتوي على Me-β-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، وحيث CD = دكسترين حلقي DD = دوديكان، Me = مثيل.
الشكل 4 : يوضح تراكيز 1-نوناديكين لكريات الخلايا JCC138 والوسط (كما تم تحديده بتقسيم الأيزو أوكتان في المحلول الطافي للمستنبت). وأعمدة الأخطاء هي عبارة عن الانحراف المعياري للعينات المناظرة.
الوصف التفصيلي للاختراع
يزوّد الشرح التالي للمصطلحات والطرق لوصف الكشف الراهن بصورة أفضل ولتوجيه أولئك الملمين في التقنية لتطبيق الكشف الراهن. وكما استخدم هنا يقصد بالمصطلح "يشتمل على" يتضمن أو يحتوي على وتشمل صيغ المفرد كل صيغ الجمع ما لم يذكر بوضوح خلاف ذلك. فعلى سبيل المثال، يقصد بعبارة "يشتمل على خلية" احتواء خلية واحدة أو مجموعة من هذه الخلية، وكذلك يقصد بعبارة "يشتمل على الثيو إستراز" احتواء ثيو إستراز ببتيد واحد أو أكثر ومكافئاته المعروفة لأولئك الملمين في التقنية وهلم جراً. ويقصد بالحرف "أو" الإشارة إلى عنصر مفرد من العناصر البديلة المذكورة أو توليفة من عنصرين أو أكثر، ما لم يذكر بوضوح خلاف ذلك.
وما لم يذكر خلاف ذلك هنا، تدل المصطلحات العلمية والفنية المستخدمة فيما يتعلق بالاختراع على معانيها التي يفهمها عموماً أولئك الملمون في التقنية. وعلاوة على ذلك، وما لم يتطلب السياق خلاف ذلك، تشمل مصطلحات المفرد كل صيغ الجمع وتشمل مصطلحات الجمع كل صيغ المفرد. وعموماً تكون مجموعة المصطلحات المستخدمة فيما يتصل بـ، والتقنيات المتعلقة بـ، الكيمياء الحيوية، علم الإنزيمات، علم الأحياء الجزيئي والخلوي، علم الأحياء الدقيقة، علم الوراثة، وكيمياء البروتينات والأحماض النووية والتهجين الموصوفة هنا هي تلك المعروفة جيداً والمستخدمة عادة في التقنية. وعموماً تجرى طرق وتقنيات الاختراع وفقاً لطرق تقليدية معروفة جيداً في التقنية وكما وصف في مراجع عامة ومخصصة بدرجة أكبر مختلفة مذكورة وموصوفة في المواصفة الحالية إلا إذا ذكر خلاف ذلك. وانظر، على سبيل المثال، المراجع Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)؛ وAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002)؛ وHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)؛ وTaylor and Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003)؛ وWorthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol. I, CRC Press (1976)؛ وHandbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol. II, CRC Press (1976)؛ وEssentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999).
وينبغي فهم المصطلحات التالية، ما لم يشار إلى خلاف ذلك، وفقاً للمدلولات التالية:
ويشير مصطلح "دكسترين حلقي" كما استخدم هنا إلى جزيء يشتمل على خمس وحدات غلوكوبيرانوز مرتبطة على الأقل. وتشتمل مركبات الدكسترين الحلقية النموذجية على وحدات غليكوبيرانوز مرتبطة بواسطة 1¬4 روابط غليكوزيديك. وقد تكون مركبات الدكسترين الحلقية غير المعدلة مخروطية الشكل بجزء داخلي لا يألف الماء وجزء خارجي يألف الماء. ويمكن استخدام مركبات الدكسترين الحلقية في تجسيد وفقاً للاختراع لالتقاط ونقل بشكل مؤقت المنتج المعني الذي أساسه الكربون. ويمكن تعديل مركبات الدكسترين الحلقية كيميائياً لتزويد الخصائص المرغوبة. وتتضمن هذه التعديلات، على سبيل المثال، عمليات المثيلة، الألكلة، الألكلة الهيدروكسية، الألكلة الكربوكسية، وإضافة مجموعة أمينو، ثيو، توسيل، غليكوسيل، أو مالتوسيل. وبشكل إضافي يمكن تحضير مشتقات الإيثرات، الإسترات، الأنهيدرو، الديوكسي، المشتقات الحمضية والقاعدية بواسطة التفاعلات الكيميائية أو الإنزيمية.
ويشير المصطلح "α-دكسترين حلقي" أو "α-CD" كما ذكر هنا إلى جزيء يشتمل على ست وحدات غلوكوبيرانوز. ويعرف هذا الجزيء أيضاً بـِ α-دكسترين شاردينغر، مالتوهكساوز حلقي، سدادسي غلوكان حلقي، سداسي أميلوز حلقي، αCD، ACD، وC6A.
ويشير المصطلح "β-دكسترين حلقي" أو "β-CD" كما ذكر هنا إلى جزيء يشتمل على سبع وحدات غلوكوبيرانوز. ويعرف هذا الجزيء أيضاً بـِ β-دكسترين شاردينغر، مالتوهبتاوز حلقي، سباعي غلوكان حلقي، سباعي أميلوز حلقي، βCD، BCD، وC7A.
ويشير المصطلح "γ-دكسترين حلقي" أو "γ-CD" كما ذكر هنا إلى جزيء يشتمل على ثمان وحدات غلوكوبيرانوز. ويعرف هذا الجزيء أيضاً بـِ γ-دكسترين شاردينغر، مالتوأوكتاوز حلقي، ثماني غلوكان حلقي، ثماني أميلوز حلقي، γCD، GCD، وC8A.
ويشير مصطلح "الجزيء النزيل" إلى جزيء يتراكب بشكل عابر مع الجزيء العائل، مثل الدكسترين الحلقي بعلاقة بنيوية فريدة بواسطة قوى غير تلك الخاصة بالروابط الثنائية الإسهامية الكاملة. وفي أحد تجسيدات الاختراع، يكون الجزيء النزيل عبارة عن المنتج المعني الذي أساسه كربون، مثل الهيدروكربون الناتج بواسطة الخلية العائلة، والجزيء العائل هو عبارة عن دكسترين حلقي يمكنه نقل الجزيء النزيل من الطور القطبي إلى الطور اللاقطبي.
ويصف المصطلح "مستنبت ثنائي الطور" كما استخدم هنا نظام مستنبت يشتمل على الأقل على طور قطبي وطور لاقطبي، حيث يمكن فصل الأطوار بشكل تلقائي عن بعضهما البعض أو يمكن تحقيق ذلك بعد خطوة الفصل بالطرد المركزي. وقد يشتمل الطور القطبي على وسط لنمو مستنبت الخلايا العائلة. وقد يشتمل الطور القطبي على جزيء أمفيفيلي (مزدوج الألفة). وقد يشتمل الطور اللاقطبي على الأقل على جزيء لا يألف الماء أو جزيء أمفيفيلي مفيد لزيادة إنتاج و/أو جمع المنتجات المعنية التي أساسها الكربون التي يتم إطلاقها بواسطة خلية عائلة. وفي تجسيد آخر، يكون الطور اللاقطبي مفيداً كمذيب للمنتجات المعنية التي أساسها الكربون.
ويصف مصطلح "مستنبت متصل" كما استخدم هنا مستنبتاً من الكائنات الحية الدقيقة في وسط سائل ينمو بانتظام لفترة زمنية ممتدة.
ويشير المصطلح "طور لاقطبي" كما استخدم هنا إلى طور مكون من جزيئات تبدي طبيعة غير أليفة للماء مختلفة عن تلك الموجودة في الطور القطبي في محلول ثنائي الطور. وتتضمن أمثلة الأطوار اللاقطبية، بدون حصر، المذيبات القطبية اللابروتينية، والمذيبات البروتينية القطبية. وفي أحد التجسيدات، يشتمل الطور اللاقطبي على هيدروكربونات، كحولات، إسترات، ألكانات، ألكينات، و/أو أحماض دهنية. وفي تجسيد آخر، يشتمل الطور اللابلوري على جزيئات مثل بنتان، بنتان حلقي، هكسان حلقي، هكسين حلقي بنزين، هكسين حلقي، إيثر بترولي، مركبات هبتان، تولوين، 1، 4-ديوكسان، كلوروفورم، ثنائي إثيل أمين، ثنائي إثيل إيثر، ثلاثي إثيل أمين، ثث-بيوتيل مثيل إيثر، ثنائي كلورو ميثان، رباعي هيدروفوران، أسيتات الإثيل، أسيتون، ثنائي مثيل فورماميد، أسيتونتريل، كبريتوكسيد ثنائي مثيل، حمض الفورميك، مثيل أيزوبيوتيل كيتون، أيزوبيوتيل الكحول، ثنائي إثيل كيتون، مثيل إثيل كيتون، عـ-بيوتانول، أيزو أميل الكحول، أيزو بروبانول، ثث-بيوتيل كحول، عـ-أوكتانول، بارا-زيلين، ميتا-زيلين، عـ-بروبانول، إيثانول، ميثانول، أسيتون، حمض الأسيتيك، ثنائي مثوكسي إيثان، بنزين، أسيتات بيوتيل، 1-كلورو بيوتان، رباعي هيدروفوران، أسيتات الإثيل، أورثو-زيلين، ثلاثي أميد سداسي مثيل فوسفور، ماء، 2-إثوكسي إثيل إيثر، N، N-ثنائي مثيل أسيتاميد، ثنائي إثيلين غليكول ثنائي مثيل إيثر، N، N-ثنائي مثيل فورماميد، 2-مثوكسي إيثانول، بيريدين، حمض بروبانويك، أسيتات 2-مثوكسي إثيل، بنزونتريل، 1-مثيل-2-بيروليدينون، سداسي مثيل فوسفوراميد، 1، 4-ديوكسان، أنهيدريد الأسيتيك، كبريتوكسيد ثنائي مثيل، كلوروبنزين، أكسيد ديوتريوم، غليكول الإثيلين، غليكول ثنائي الإثيلين، كربونات البروبيلين، حمض الفورميك، 1، 2-ثنائي كلورو إيثان، غليسرين، ثنائي كبريتيد الكربون، 1، 2-ثنائي كلوروبنزين، كلوريد المثيلين، نتروميثان، 2، 2، 2-ثلاثي فلورو إيثانول، 1، 1، 2-ثلاثي كلورو ثلاثي فلورو إيثان، رباعي كلوريد الكربون، و/أو رباعي كلورو إثيلين. وفي تجسيد آخر، يتضمن الطور اللاقطبي دوديكان. وفي تجسيد آخر بديل، يشتمل المذيب اللاقطبي على مركب واحد على الأقل من المجموعة المكونة من دوديكان، هكساديكان، ثنائي-2-إثيل هكسيل فثالات-BEHP، ومركب بالعلامة التجارية Fluorinert® FC-70. ويمكن أن يتضمن المذيب اللاقطبي بشكل اختياري مادة خافضة للتوتر السطحي مثل دوديسيل كبريتات الصوديوم. وفي بعض تجسيدات الاختراع، يكون المنتج المعني الذي أساسه الكربون قابل للذوبان في الطور اللاقطبي. وفي تجسيدات أخرى للاختراع، يشتمل الطور اللاقطبي على المركب المعني الذي أساسه الكربون. وفي تجسيد آخر للاختراع، تشتمل المذيبات العضوية في الطور اللاقطبي مركبات هكسان، مركبات أوكتان، مركبات ديكان، و/أو مركبات دوديكان. وفي تجسيد آخر أيضاً، تشتمل مركبات الألكان على أي من أو كل من الأشكال الخطية أو المتفرعة. وفي تجسيد آخر أيضاً، يشتمل الطور اللاقطبي على هيدروكربون خطي ومتفرع. وفي أحد أوجه الاختراع، يشتمل الهيدروكربون على سلسلة بها من 6 إلى 30 جزيء كربوني. وفي تجسيد آخر أيضاً للاختراع، يختار الطور اللاقطبي بناء على درجة حرارة المستنبت ثنائي الطور لتقليل تبخير الطور اللاقطبي تحت ظروف الاستنبات. وفي تجسيد آخر، يختار الطور اللاقطبي بناء على مشاركته في استخلاص الجزيئات المعنية التي أساسها الكربون من خلية عائلة.
ويشير المصطلح "طور قطبي" كما استخدم هنا إلى طور مكون من جزيئات تظهر طبيعة أكثر ألفة نحو الماء مقارنة بطبيعة الطور اللاقطبي في محلول ثنائي الطور. وفي أحد تجسيدات الاختراع، يشتمل الطور القطبي على وسط مستنبت خلايا. وفي تجسيد آخر للاختراع، يشتمل الطور القطبي أيضاً على مركبات دكسترين حلقي.
ويُراد من المصطلح "خلية عائلة معدلة" (أو ببساطة "خلية عائلة")، كما استُخدم هنا، أنْ يشير إلى خلية تم إدخال ناقل مأشوب فيها. ويجدر فهم أنه يُراد من هذه المصطلحات ألا تشير إلى الخلية التابعة الخاصة فحسب بل إلى سلالة تلك الخلية. ونظراً إلى احتمالية حدوث تعديلات معينة في الأجيال المتعاقبة إما بسبب الطفرات أو الآثار البيئية، ربما لن تكون تلك السلالة، في الواقع، مطابقة للخلية الأمّ، لكن لا تزال ضمن نطاق مصطلح "الخلية العائلة المعدلة" المستخدم هنا. والخلية العائلة المأشوبة هي خلية معزولة أو نسل خلوي زرعت في مستنبت أو قد تكون خلية مستقرة في نسيج حيّ أو كائن حيّ دقيق. ويتضمن مصطلح "خلية عائلة" بدون تحديده التعريف المراد لمصطلح "خلية عائلة معدلة".
وكما استخدم هنا، فإن مصطلح "الجزيء" يعني أي مركب، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، جزيء صغير، ببتيد، بروتين، سكر، نكليوتيد، حمض نووي، شحم وغيرها ويمكن أن يكون هذا المركب طبيعي أو اصطناعي.
ويشير مصطلح "الكتلة الحيوية" إلى مادة حيوية ينتجها النظام الحيوي بما في ذلك مادة مفيدة كمصدر للطاقة المتجددة.
ويشير المصطلح "هيدروكربون" بوجه عام إلى مركب كيميائي مكون من عناصر كربون (C)، هيدروجين (H) وأكسجين بشكل اختياري (O). وهناك ثلاثة أنواع أساسية من الهيدروكربونات، مثل الهيدروكربونات العطرية، الهيدروكربونات المشبعة والهيدروكربونات غير المشبعة مثل مركبات الألكين، مركبات الألكاين، ومركبات الديين. ويتضمن المصطلح أيضاً وقود، وقود حيوي، بلاستيك، شموع، مذيبات وزيوت.
ويشير المصطلح "وقود حيوي" كما استخدم هنا إلى أي وقود يحصل عليه من مصدر حيوي. ويشير الوقود الحيوي إلى هيدروكربون واحد أو أكثر، كحول واحد أو أكثر، إستر دهني واحد أو أكثر أو مخاليط منها. وبشكل بديل، تستخدم الهيدروكربونات السائلة.
ويشير مصطلح "مكون الوقود" إلى أي مركب أو خليط من المركبات الذي يستخدم لتشكيل تركيب وقود. وهنالك "مكونات وقود رئيسية" و"مكونات وقود ثانوية". ويتواجد مكون الوقود الرئيسي في تركيب الوقود بنسبة تبلغ 50٪ حجماً على الأقل، بينما يتواجد مكون الوقود الثانوي في تركيب الوقود بنسبة تقل عن 50٪.وتعتبر المواد المضافة للوقود من مكونات الوقود الثانوية.
ويتضمن مصطلح "الإستر الدهني" أي إستر مكون من حمض دهني. وقد تحتوي السلاسل الكربونية في الأحماض الدهنية على أية توليفة من التعديلات الموصوفة هنا. فعلى سبيل المثال، يمكن أن تحتوي السلسلة الكربونية على موقع واحد أو أكثر من المواقع غير المشبعة، مواقع التفرع، بما في ذلك التفرع الحلقي، ويمكن توجيهها بحيث تصبح سلسلة طويلة أو قصيرة. ويمكن استخدام أي كحول لتشكيل إسترات الأحماض الدهنية، مثل مركبات الكحول التي تيم الحصول عليها من مسار التصنيع الحيوي للحمض الدهني، مركبات الكحول الناتجة عن طريق إنتاج العائل بواسطة مسارات تصنيع حيوي لحمض غير دهني، مركبات الكحول المزودة في تخمر المَرَق.
ويشير مصطلح "الحمض الدهني" إلى منتجات أو مشتقات منه مكونة جزئياً من خلال مسار التصنيع الحيوي للحمض الدهني في الكائن الحي الدقيق العائل. ويتضمن مسار التصنيع الحيوي للحمض الدهني إنزيمات سينثاز للحمض الدهني التي يمكن توجيهها كما وصف هنا لإنتاج مشتقات الحمض الدهني، وفي بعض الأمثلة يمكن التعبير عنه باستخدام إنزيمات إضافية لإنتاج مشتقات الحمض الدهني التي لها خصائص السلسلة الكربونية المرغوبة. وتتضمن مشتقات الحمض الدهني التمثيلية على سبيل المثال، مركبات كحول قصيرة وطويلة السلسلة، هيدروكربونات، وإسترات أحماض دهنية بما في ذلك الشموع.
ويشتمل المصطلح "منتجات معنية أساسها الكربون" كحولات مثل إيثانول، بروبانول، أيزوبروبانول، بيوتانول، أحماض دهنية، استرات أحماض دهنية، استرات شمعية؛ هيدروكربونات وألكانات مثل البروبان، الأوكتان، الديزل، مادة داسرة نفاثة 8 (JP8)؛ بوليمرات مثل ثيرفثالات، 1، 3-بروبان دايول، 1، 4-بيوتان دايول، متعددات هيدروكسيل، مركبات متعدد هيدروكسي ألكانوات (PHA)، متعدد بيتا هيدروكسي بيوتيرات (PHB)، أكريلات، حمض الأديبيك، إبسيلون-كبرولاكتون، أيزوبرين، كبرولاكتام، مطاط؛ سلع كيميائية مثل اللاكتات، حمض دوكوزاهكسائينويك (DHA)، 3-هيدروكسي بروبيونات، γ-فاليرو لاكتون، لايزين، سيرين، أسبارتات، حمض الأسبارتيك، سوربيتول، أسكوربات، حمض الأسكوربيك، أيزوبنتينول، لانوستيرول، أوميغا-3 DHA، ليكوبين، إيتاكونات، 1، 3- بيوتادايين، اثيلين، بروبيلين، سكسينات، سيترات، حمض الستريك، الغلوتامات، المالات، وحمض 3 – هيدروكسي بروبيونيك (HPA)، حمض اللاكتيك، THF، غاما بيوتيرو لاكتون، مركبات بيروليدين، هيدروكسي بيوتيرات، حمض الجلوتاميك، حمض الليفولينيك، حمض الاكريليك، وحمض المالونيك؛ مواد كيميائية خاصة مثل أشباه الكاروتين، أشباه أيزوبرين، حمض إيتاكونيك المستحضرات الصيدلانية والمركبات الوسيطة الصيدلانية مثل حمض 7- أمينو دياسيتوكسي سيفالوسبورانيك (7ADCA)/ سيفالوسبورين، اريثرومايسين، متعددات كيتيد، ستاتين، باكليتاكسيل، دوسيتاكسيل، مركبات تربين، ببتيد، ستيرويدات، الأحماض الدهنية أوميغا، أولفينات وألكينات وغيرها من المنتجات المناسبة المعنية. وهذه المنتجات تكون مفيدة في سياق الكلام عن الوقود، المواد الكيميائية الصناعية والخاصة، مثل مواد وسيطة تستخدم في صنع منتجات إضافية، مثل المكملات الغذائية، المستحضرات الغذائية، البوليمرات، بدائل البارافين، منتجات العناية الشخصية والمستحضرات الصيدلانية.
ويشير المصطلح "تقويضي" و"تقويض" كما استخدم هنا إلى عملية تحلل جزيء أو تفكك الجزيئات الكبيرة إلى جزيئات أصغر. ويشير "تقويضي" أو "تقويض" إلى مسار تفاعل معين حيث يحدث تحلل لجزيء بواسطة مكون حفزي واحد أو عدة مكونات حفزية أو عملية الخلية الكاملة العامة حيث يحدث تحلل لجزيء باستخدام أكثر من مسار تفاعل محدد وعدد كبير من المكونات الحفزية.
ويشير المصطلح "ابتنائي" و"ابتناء" كما استخدم هنا إلى عملية البناء الكيميائي للجزيئات الصغيرة إلى الجزيئات الكبيرة. ويشير ابتنائي إلى مسار تفاعل معين حيث يحدث بناء الجزيء بواسطة مكون حفزي واحد أو عدة مكونات حفزية أو عملية الخلية الكاملة العامة حيث يحدث بناء الجزيء باستخدام أكثر من مسار تفاعل محدد وعدد كبير من المكونات الحفزية.
ويشير المصطلح "داخلي المنشأ" كما هو مستخدم هنا عند الإشارة إلى جزيء الحمض النووي وخلية معينة أو كائن حي دقيق معين إلى تسلسل الحمض النووي أو الببتيد الموجود في الخلية ولم يتم إدخاله في الخلية (أو أسلافها) باستخدام تقنيات الهندسة المأشوبة. على سبيل المثال، الجينات التي كانت موجودة في الخلية عندما تم عزل الخلية أصلا من الطبيعة. ولا تزال تعتبر الجينات بأنها داخلية المنشأ إذا تم تعديل التسلسلات الضابطة، مثل التسلسلات المحضضة أو المعززة التي تنشط النسخ أو الترجمة من خلال تقنيات التأشب.
ويشير المصطلح "خارجي المنشأ" كما هو مستخدم هنا عند الإشارة إلى جزيء الحمض النووي وخلية معينة أو كائن حي دقيق معين إلى تسلسل الحمض النووي أو الببتيد غير الموجود في الخلية عندما تم عزل الخلية أصلا من الطبيعة. على سبيل المثال يكون الحمض النووي الذي أنتج في كائن حي دقيق مختلف وتم تعديله هندسياً إلى خلية بديلة باستخدام تقنيات الـ DNA المأشوب أو طرق أخرى لتحرير هذا الحمض النووي خارجي المنشأ.
ويشير المصطلح "إطلاق"، كما هو مستخدم هنا إلى حركة مركب من داخل الخلية (خلوي داخلي) إلى خارج الخلية (خلوي خارجي). ويمكن أن تكون الحركة فعالة أو غير فعالة. وعندما يكون الإطلاق فعالاً فإنه يمكن تسريعه بواسطة ببتيد ناقل واحد أو أكثر وفي بعض الأمثلة يمكن أن يستهلك الطاقة. وعندما يكون الإطلاق غير فعال، فإنه يمكن أن يحدث من خلال الانتشار عبر الغشاء، ويمكن تسريعه عن طريق الاستمرار بجمع المركب المرغوب من البيئة خارج الخلية، وبالتالي تشجيع المزيد من الانتشار. ويمكن أيضا إطلاق مركب عن طريق تحليل خلية. ويمكن أن تؤثر المركبات الخلوية الخارجية في الأوساط الخلوية على إطلاق مركب.
ويشير المصطلحان "قابل للامتزاج" أو "قابلية الامتزاج" إلى عدم القدرة النسبية للمركب على الذوبان في الماء وتُحدد بمعامل تقاسم المركبات. ويُعرَّف معامل التقاسم، P، بأنه التركيز عند الاتزان للمركب في الطور العضوي (يكون الطور العضوي في نظام ثنائي الطور عادة عبارة عن الطور المتكون من مشتقة الحمض الدهني أثناء عملية الانتاج غير أنه في بعض الأمثلة يمكن تزويد طور عضوي، مثل طبقة من الدوديكان لتسريع فصل المنتجات) مقسوماً على التركيز عند الاتزان في الطور المائي (أي مرق التخمير). وعند وصف نظام ثنائي الطور فإنه يتم وصف P عادة بدلالة logP. ويقسَّم المركب الذي له logP يساوي 10 بنسبة 1:10 في الطور العضوي بينما يقسَّم المركب الذي له logP يساوي 0.1 بنسبة 1:10 في الطور المائي.
ويشير مصطلح "ظروف التخمير المناسبة" عموما إلى أوساط التخمير والظروف القابلة للتعديل مثل، درجة الحموضة ودرجة الحرارة ومستويات التهوية، الخ، ويفضل الظروف المثلى التي تسمح للكائنات الحية الدقيقة بإنتاج المنتجات المعنية التي أساسها الكربون. ولتحديد فيما إذا كانت ظروف الاستنبات تسمح بإنتاج المنتج، فإنه يمكن استنبات الكائنات الحية الدقيقة لمدة حوالي 24 ساعة إلى أسبوع واحد بعد التلقيح، ويمكن الحصول على عينة وتحليلها. ويتم اختبار الخلايا في العينة أو الوسط الذي تم فيه زراعة الخلايا لتحديد وجود المنتج المرغوب.
وتوصف طرق ومواد نموذجية أدناه، على الرغم من أنه يمكن استخدام طرق ومواد مماثلة أو مساوية لتلك الموصوفة هنا أيضا عند تطبيق الاختراع، وسوف تكون واضحة لأولئك المتمرسين في التقنية. ولقد دمجت جميع النشرات وغيرها من المراجع المذكورة هنا للرجوع إليها في مجملها. وفي حالة التعارض، سيتم الرجوع إلى المواصفة الحالية متضمنة التعريفات. وتكون المواد والطرق والأمثلة توضيحية فقط وليس المقصود منها أن تكون محددة.
وخلال هذه المواصفة وعناصر الحماية، سيكون مفهوما أن كلمة "يشتمل" واشتقاقاتها تدل على تضمين العدد الصحيح المذكور أو المجموعة المذكورة من الأعداد الصحيحة ولكن ليس استبعاد أي عدد صحيح آخر أو مجموعة أخرى من الأعداد الصحيحة.
مجال الاختراع
يتعلق الكشف الراهن بتراكيب وعمليات استخلاص كيميائية، وأكثر تحديداً، يتعلق الاختراع باستخدام جزيئات دكسترين حلقية لاستخلاص هيدروكربونات مثل ألكانات، ألكينات، وإسترات لأحماض دهنية من خلايا عائلة منتجة ونقلها إلى طبقة مذيب في نظام ثنائي الطور.
خلفية الاختراع
تتلقى إزالة الجزيئات حيوية المنشأ المنتجة بواسطة مستنبت للخلايا في وسط استنبات للخلايا اهتماماً خاصاً من البحوث في مجال إنتاج الوقود الحيوي من كائنات حية عائلة. وثمة حاجة لعمليات جديدة لاستخلاص منتجات أساسها الكربون معينة بشكل فعال من مستنبت للخلايا العائلة قادر على إنتاج منتجات أساسها الكربون معينة.
ومركبات الدكسترين الحلقية هي عبارة عن مركبات سكريد قليلة الحدود حلقية مؤلفة من وحدات ألفا-غلوكوز مرتبطة عند المواقع (1، 4). وتوجد عادة في صورة حلقات مكونة من 6 أعضاء (مركبات α-دكسترين حلقية)، 7 أعضاء (مركبات β-دكسترين حلقية) أو 8 أعضاء (مركبات β-دكسترين حلقية)، ومع ذلك، توجد العديد من الأشكال البديلة، بما في ذلك حلقات مكونة من 32 وحدة مميَّزة جيداً، وتعرف أيضاً مركبات سكريد قليلة الحدود حلقية تشتمل على 150 عضو على الأقل. وحضِّرت العديد من مشتقات الدكسترين الحلقي، بما في ذلك أشكال أشكال ممثيلة، يمكن إنتاجها عن طريق مفاعلة الدكسترين الحلقي الأصلي مع هاليدات مثيل. ولمركبات الدكسترين الحلقية خصائص أمفيفاتية حيث تتضمن جزء خارجي محب للماء وجزء داخلي كاره للماء، مما يتيح لها إذابة الجزيئات غير القطبية في أوساط مائية. وثمة عدة استخدامات لها، وتستخدم على نطاق واسع في الصناعات الصيدلانية، الغذائية والتجميلية؛ انظر، على سبيل المثال، المرجع Del Valle, E.M.M., Process Biochemistry, 39:1033-1046 (2004).
وتتيح مركبات الدكسترين الحلقية ومشتقاتها موازنة سريعة للكولسترول بين الحويصلات (Leventis, R., et al., Biophysical Journal, 81:2257-2267 (2001))، ويمكنها أيضاً إزالة الكولسترول من خلايا رغوية بلعمية (Atger, V.M., et al., J. Clin. Invest., 99:773-780 (1997)). وتؤدي إضافة مركبات الدكسترين الحلقية إلى مستنبتات بكتيرية محللة للهيدروكربون إلى زيادة معدَّل تقويض الألكان عن طريق زيادة ذائبية الألكانات في الأوساط المائية (Sivaraman, C., et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology, 26:227-232 (2010)). ويكفل الاختراع الموصوف في هذه المواصفة أن إضافة مركبات الدكسترين الحلقية إلى مستنبتات تحتوي على الهيدروكربون (مثلاً، وقود ديزل، وجزيئات مصدرية ذات صلة) تنتج سلالات من خلايا عائلة، مثلاً، البكتيريا الزرقاء (البكتيريا السيانية)، مما يتيح استخلاص هيدروكربونات نموذجية، مثلاً ألكانات، ألكينات، و/أو إسترات لأحماض دهنية ونقل هذه الجزيئات الكارهة للماء إلى طبقة المذيب في نظام ثنائي الطور.
الكشف عن الاختراع
يتعلق الاختراع الراهن بطرق وتراكيب تستخدم لاستخلاص جزيئات أساسها الكربون من خلية عائلة. ويمكن استخلاص جزيئات أساسها كربون مختلفة من خلية عائلة ونقلها إلى طبقة مذيب في نظام ثنائي الطور باستخدام جزيء دكسترين حلقي للمساعدة في النقل بين الخلية وطبقة المذيب.
وبالتالي، يزود الاختراع طريقة لاستخلاص جزيء أساسه الكربون من خلية عائلة تتضمن ملامسة خلية عائلة مع محلول بحيث يشتمل المحلول على دكسترين حلقي واحد على الأقل. وفي أحد تجسيدات الاختراع، تعتبر الخلية العائلة خلية بدائية النواة.
وفي أحد أوجه الاختراع الراهن، يكون الجزيء الذي أساسه كربون غير قطبي. وفي وجه آخر للاختراع الراهن، يكون الجزيء الذي أساسه كربون عبارة عن جزيء وقود أليف الشحم. وفي أحد تجسيدات الاختراع الراهن، يكون الجزيء الذي أساسه كربون عبارة عن هيدروكربون طويل السلسلة. ويمكن أن يكون الهيدروكربون طويل السلسلة وفقاً لهذا التجسيد عبارة عن ألكان طويل السلسلة وقد يكون عبارة عن ألكين طويل السلسلة. وفي تجسيد بديل، يكون الألكان طويل السلسلة عبارة عن خماسي ديكان، سداسي ديكان، أو سباعي ديكان.
وفي تجسيد آخر للاختراع الراهن، يكون الجزيء الذي أساسه كربون عبارة عن ألكان، ألكين، أو إستر لحمض دهني. وفي تجسيد بديل للاختراع، يكون الجزيء الذي أساسه كربون عبارة عن 1-نوناديكين، خماسي ديكان، سداسي ديكان، سباعي ديكان أو إستر بيوتيل لحمض دهني. وفي بعض الأوجه، قد يكون إستر بيوتيل الحمض الدهني عبارة عن ميريستات بيوتيل، بلميتات بيوتيل، سباعي ديكانوات بيوتيل، أوليئات بيوتيل، أو ستيارات بيوتيل.
وفي أحد الأوجه، تكون الخلية بدائية النواة عبارة عن كائن حي ضوئي التخليق. وفي وجه آخر، يكون الكائن الحي ضوئي التخليق عبارة عن بكتيريا زرقاء. وفي أحد التجسيدات، تتضمن الخلية بدائية النواة تعديل جيني واحد على الأقل. وفي تجسيد آخر، يخفض التعديل الجيني طبقة S في الخلية بدائية النواة. وفي تجسيد بديل، يخفض التعديل الجيني التركيب النسبي للكنان السكري في الخلية بدائية النواة.
وفي بعض الأوجه، تحتوي الخلية بدائية النواة على مسار نقل معبَّر عنه بشكل مغاير واحد أو أكثر. وتزوَّد أيضاً أوجه تشتمل فيها الخلية بدائية النواة على بروتين واحد على الأقل معبَّر عنه بشكل مفرط. وفي أحد التجسيدات، تعتبر هذه البروتينات المعبَّر عنها بشكل مفرط جزءاً من مسارات النقل المعبَّر عنها بشكل مغاير. وفي تجسيد آخر، يشارك المكون البروتيني في مسار النقل المعبَّر عنه بشكل مغاير في نقل الجزيئات التي أساسها كربون إلى الغشاء الخارجي للخلية بدائية النواة. وفي وجه إضافي، يتم تعديل التعبير عن الجين الذي يشفر المكون البروتيني. وفي وجه آخر، تتم زيادة التعبير عن الجين الذي يشفر المكون البروتيني.
وفي وجه آخر، يزود الاختراع الراهن أيضاً نقل لجزيء محب للماء واحد على الأقل من خلية بدائية النواة إلى طبقة مذيب. وفي أحد التجسيدات، تستخدم الطريقة وسط استنبات للخلايا ثنائي الطور. وفي أحد الأوجه، يشتمل وسط استنبات الخلايا ثنائي الطور على طور غير قطبي يتألف من دوديكان. وفي وجه آخر، يشتمل وسط استنبات الخلايا ثنائي الطور على طور غير قطبي يتألف من هيدروكربون، حيث يتراوح عدد ذرات الكربون في الهيدروكربون من 6 إلى 30. وفي تجسيد آخر، يشتمل الوسط على مادة مضادة للتأكسد واحدة على الأقل. وفي تجسيد آخر، تشتمل المادة المضادة للتأكسد على هيدروكسي تولوين معالج بالبيوتيل. وفي تجسيد آخر أيضاً، يشتمل الوسط على معيار داخلي واحد على الأقل. وفي تجسيد آخر، يشتمل المعيار الداخلي على هبتاكوسان.
وفي أحد التجسيدات، يمكن أن يكون الدكسترين الحلقي وفقاً للاختراع الراهن عبارة عن α-دكسترين حلقي، β-دكسترين حلقي، أو γ-دكسترين حلقي. وفي بعض التجسيدات، يشتمل الدكسترين الحلقي على تعديل. وفي تجسيد آخر، يعالج الدكسترين الحلقي بالمثيل. وفي تجسيد آخر، يكون الدكسترين الحلقي عبارة عن مثيل-β-دكسترين حلقي.
وفي تجسيد آخر، يزود الاختراع طريقة يزيد فيها الدكسترين الحلقي من نقل المنتج الذي أساسه كربون إلى الطور غير القطبي في محلول ثنائي الطور، مثلاً، وسط استنبات للخلايا. وفي أحد التجسيدات، تتم إزالة المنتجات التي أساسها كربون من المحلول. وفي تجسيد آخر، يزود الاختراع طريقة لاستنبات خلية بدائية النواة لإنتاج جزيء أساسه كربون في خطوات تتضمن: استنبات الخلية بدائية النواة في وسط ثنائي الطور يشتمل على دكسترين حلقي واحد على الأقل، حيث تنتج الخلية بدائية النواة الجزيء الذي أساسه الكربون؛ وجمع الجزيء الذي أساسه كربون من الطور غير القطبي في الوسط ثنائي الطور. وفي وجه آخر للاختراع، يتم تنفيذ خطوات استنبات الخلايا بدائية النواة في وسط ثنائي الطور يشتمل على دكسترين حلقي واحد على الأقل وجمع الجزيء الذي أساسه كربون من الطور غير القطبي بشكل متكرر. ويتيح هذا الوجه للاختراع، استنبات متواصل للخلايا بدائية النواة وبعد ذلك إنتاج وجمع الجزيء الذي أساسه كربون المنتج بواسطة الخلايا بدائية النواة بشكل متكرر.
ويزود الاختراع الراهن أيضاً تركيب مفيد لاستخلاص الجزيء الذي أساسه كربون من خلية عائلة، بحيث يشتمل التركيب على خلية بدائية النواة ووسط ثنائي الطور يحتوي على دكسترين حلقي واحد على الأقل. وفي تجسيد آخر، يتم عموماً تعديل الخلية بدائية النواة في التركيب. وفي تجسيد آخر، تنتج الخلية بدائية النواة جزيء أساسه كربون. وفي تجسيد آخر، يكون الجزيء الذي أساسه كربون عبارة عن ألكان، ألكين أو إستر لحمض دهني.
وصف مختصر للرسوم
الشكل 1 : يمثل رسماً بيانياً يوضح تراكم مركبات الألكان في غطاء الدوديكان للمستنبتات JCC1469، حيث CD = دكسترين حلقي، وMe = مثيل.
الشكل 2 : يمثل مجموعة من الرسوم البيانية التي توضح محتوى الألكان المرافق لخلية JCC1469 مع الزمن، حيث (أ) مستنبتات تحتوي على α-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، (ب) مستنبتات تحتوي على β-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، (جـ) مستنبتات تحتوي على Me-β-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، وحيث CD = دكسترين حلقي DD = دوديكان، Me = مثيل.
الشكل 3 : يوضح كثافات الخلايا في المستنبت JCC1469 بعد إضافة مركبات دكسترين حلقي و/أو دوديكان، حيث (أ) مستنبتات تحتوي على α-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، (ب) مستنبتات تحتوي على β-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، (جـ) مستنبتات تحتوي على Me-β-CD ومستنبت ضابط لا يشتمل على CDs، وحيث CD = دكسترين حلقي DD = دوديكان، Me = مثيل.
الشكل 4 : يوضح تراكيز 1-نوناديكين لكريات الخلايا JCC138 والوسط (كما تم تحديده بتقسيم الأيزو أوكتان في المحلول الطافي للمستنبت). وأعمدة الأخطاء هي عبارة عن الانحراف المعياري للعينات المناظرة.
الوصف التفصيلي للاختراع
يزوّد الشرح التالي للمصطلحات والطرق لوصف الكشف الراهن بصورة أفضل ولتوجيه أولئك الملمين في التقنية لتطبيق الكشف الراهن. وكما استخدم هنا يقصد بالمصطلح "يشتمل على" يتضمن أو يحتوي على وتشمل صيغ المفرد كل صيغ الجمع ما لم يذكر بوضوح خلاف ذلك. فعلى سبيل المثال، يقصد بعبارة "يشتمل على خلية" احتواء خلية واحدة أو مجموعة من هذه الخلية، وكذلك يقصد بعبارة "يشتمل على الثيو إستراز" احتواء ثيو إستراز ببتيد واحد أو أكثر ومكافئاته المعروفة لأولئك الملمين في التقنية وهلم جراً. ويقصد بالحرف "أو" الإشارة إلى عنصر مفرد من العناصر البديلة المذكورة أو توليفة من عنصرين أو أكثر، ما لم يذكر بوضوح خلاف ذلك.
وما لم يذكر خلاف ذلك هنا، تدل المصطلحات العلمية والفنية المستخدمة فيما يتعلق بالاختراع على معانيها التي يفهمها عموماً أولئك الملمون في التقنية. وعلاوة على ذلك، وما لم يتطلب السياق خلاف ذلك، تشمل مصطلحات المفرد كل صيغ الجمع وتشمل مصطلحات الجمع كل صيغ المفرد. وعموماً تكون مجموعة المصطلحات المستخدمة فيما يتصل بـ، والتقنيات المتعلقة بـ، الكيمياء الحيوية، علم الإنزيمات، علم الأحياء الجزيئي والخلوي، علم الأحياء الدقيقة، علم الوراثة، وكيمياء البروتينات والأحماض النووية والتهجين الموصوفة هنا هي تلك المعروفة جيداً والمستخدمة عادة في التقنية. وعموماً تجرى طرق وتقنيات الاختراع وفقاً لطرق تقليدية معروفة جيداً في التقنية وكما وصف في مراجع عامة ومخصصة بدرجة أكبر مختلفة مذكورة وموصوفة في المواصفة الحالية إلا إذا ذكر خلاف ذلك. وانظر، على سبيل المثال، المراجع Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)؛ وAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002)؛ وHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)؛ وTaylor and Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003)؛ وWorthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol. I, CRC Press (1976)؛ وHandbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol. II, CRC Press (1976)؛ وEssentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999).
وينبغي فهم المصطلحات التالية، ما لم يشار إلى خلاف ذلك، وفقاً للمدلولات التالية:
ويشير مصطلح "دكسترين حلقي" كما استخدم هنا إلى جزيء يشتمل على خمس وحدات غلوكوبيرانوز مرتبطة على الأقل. وتشتمل مركبات الدكسترين الحلقية النموذجية على وحدات غليكوبيرانوز مرتبطة بواسطة 1¬4 روابط غليكوزيديك. وقد تكون مركبات الدكسترين الحلقية غير المعدلة مخروطية الشكل بجزء داخلي لا يألف الماء وجزء خارجي يألف الماء. ويمكن استخدام مركبات الدكسترين الحلقية في تجسيد وفقاً للاختراع لالتقاط ونقل بشكل مؤقت المنتج المعني الذي أساسه الكربون. ويمكن تعديل مركبات الدكسترين الحلقية كيميائياً لتزويد الخصائص المرغوبة. وتتضمن هذه التعديلات، على سبيل المثال، عمليات المثيلة، الألكلة، الألكلة الهيدروكسية، الألكلة الكربوكسية، وإضافة مجموعة أمينو، ثيو، توسيل، غليكوسيل، أو مالتوسيل. وبشكل إضافي يمكن تحضير مشتقات الإيثرات، الإسترات، الأنهيدرو، الديوكسي، المشتقات الحمضية والقاعدية بواسطة التفاعلات الكيميائية أو الإنزيمية.
ويشير المصطلح "α-دكسترين حلقي" أو "α-CD" كما ذكر هنا إلى جزيء يشتمل على ست وحدات غلوكوبيرانوز. ويعرف هذا الجزيء أيضاً بـِ α-دكسترين شاردينغر، مالتوهكساوز حلقي، سدادسي غلوكان حلقي، سداسي أميلوز حلقي، αCD، ACD، وC6A.
ويشير المصطلح "β-دكسترين حلقي" أو "β-CD" كما ذكر هنا إلى جزيء يشتمل على سبع وحدات غلوكوبيرانوز. ويعرف هذا الجزيء أيضاً بـِ β-دكسترين شاردينغر، مالتوهبتاوز حلقي، سباعي غلوكان حلقي، سباعي أميلوز حلقي، βCD، BCD، وC7A.
ويشير المصطلح "γ-دكسترين حلقي" أو "γ-CD" كما ذكر هنا إلى جزيء يشتمل على ثمان وحدات غلوكوبيرانوز. ويعرف هذا الجزيء أيضاً بـِ γ-دكسترين شاردينغر، مالتوأوكتاوز حلقي، ثماني غلوكان حلقي، ثماني أميلوز حلقي، γCD، GCD، وC8A.
ويشير مصطلح "الجزيء النزيل" إلى جزيء يتراكب بشكل عابر مع الجزيء العائل، مثل الدكسترين الحلقي بعلاقة بنيوية فريدة بواسطة قوى غير تلك الخاصة بالروابط الثنائية الإسهامية الكاملة. وفي أحد تجسيدات الاختراع، يكون الجزيء النزيل عبارة عن المنتج المعني الذي أساسه كربون، مثل الهيدروكربون الناتج بواسطة الخلية العائلة، والجزيء العائل هو عبارة عن دكسترين حلقي يمكنه نقل الجزيء النزيل من الطور القطبي إلى الطور اللاقطبي.
ويصف المصطلح "مستنبت ثنائي الطور" كما استخدم هنا نظام مستنبت يشتمل على الأقل على طور قطبي وطور لاقطبي، حيث يمكن فصل الأطوار بشكل تلقائي عن بعضهما البعض أو يمكن تحقيق ذلك بعد خطوة الفصل بالطرد المركزي. وقد يشتمل الطور القطبي على وسط لنمو مستنبت الخلايا العائلة. وقد يشتمل الطور القطبي على جزيء أمفيفيلي (مزدوج الألفة). وقد يشتمل الطور اللاقطبي على الأقل على جزيء لا يألف الماء أو جزيء أمفيفيلي مفيد لزيادة إنتاج و/أو جمع المنتجات المعنية التي أساسها الكربون التي يتم إطلاقها بواسطة خلية عائلة. وفي تجسيد آخر، يكون الطور اللاقطبي مفيداً كمذيب للمنتجات المعنية التي أساسها الكربون.
ويصف مصطلح "مستنبت متصل" كما استخدم هنا مستنبتاً من الكائنات الحية الدقيقة في وسط سائل ينمو بانتظام لفترة زمنية ممتدة.
ويشير المصطلح "طور لاقطبي" كما استخدم هنا إلى طور مكون من جزيئات تبدي طبيعة غير أليفة للماء مختلفة عن تلك الموجودة في الطور القطبي في محلول ثنائي الطور. وتتضمن أمثلة الأطوار اللاقطبية، بدون حصر، المذيبات القطبية اللابروتينية، والمذيبات البروتينية القطبية. وفي أحد التجسيدات، يشتمل الطور اللاقطبي على هيدروكربونات، كحولات، إسترات، ألكانات، ألكينات، و/أو أحماض دهنية. وفي تجسيد آخر، يشتمل الطور اللابلوري على جزيئات مثل بنتان، بنتان حلقي، هكسان حلقي، هكسين حلقي بنزين، هكسين حلقي، إيثر بترولي، مركبات هبتان، تولوين، 1، 4-ديوكسان، كلوروفورم، ثنائي إثيل أمين، ثنائي إثيل إيثر، ثلاثي إثيل أمين، ثث-بيوتيل مثيل إيثر، ثنائي كلورو ميثان، رباعي هيدروفوران، أسيتات الإثيل، أسيتون، ثنائي مثيل فورماميد، أسيتونتريل، كبريتوكسيد ثنائي مثيل، حمض الفورميك، مثيل أيزوبيوتيل كيتون، أيزوبيوتيل الكحول، ثنائي إثيل كيتون، مثيل إثيل كيتون، عـ-بيوتانول، أيزو أميل الكحول، أيزو بروبانول، ثث-بيوتيل كحول، عـ-أوكتانول، بارا-زيلين، ميتا-زيلين، عـ-بروبانول، إيثانول، ميثانول، أسيتون، حمض الأسيتيك، ثنائي مثوكسي إيثان، بنزين، أسيتات بيوتيل، 1-كلورو بيوتان، رباعي هيدروفوران، أسيتات الإثيل، أورثو-زيلين، ثلاثي أميد سداسي مثيل فوسفور، ماء، 2-إثوكسي إثيل إيثر، N، N-ثنائي مثيل أسيتاميد، ثنائي إثيلين غليكول ثنائي مثيل إيثر، N، N-ثنائي مثيل فورماميد، 2-مثوكسي إيثانول، بيريدين، حمض بروبانويك، أسيتات 2-مثوكسي إثيل، بنزونتريل، 1-مثيل-2-بيروليدينون، سداسي مثيل فوسفوراميد، 1، 4-ديوكسان، أنهيدريد الأسيتيك، كبريتوكسيد ثنائي مثيل، كلوروبنزين، أكسيد ديوتريوم، غليكول الإثيلين، غليكول ثنائي الإثيلين، كربونات البروبيلين، حمض الفورميك، 1، 2-ثنائي كلورو إيثان، غليسرين، ثنائي كبريتيد الكربون، 1، 2-ثنائي كلوروبنزين، كلوريد المثيلين، نتروميثان، 2، 2، 2-ثلاثي فلورو إيثانول، 1، 1، 2-ثلاثي كلورو ثلاثي فلورو إيثان، رباعي كلوريد الكربون، و/أو رباعي كلورو إثيلين. وفي تجسيد آخر، يتضمن الطور اللاقطبي دوديكان. وفي تجسيد آخر بديل، يشتمل المذيب اللاقطبي على مركب واحد على الأقل من المجموعة المكونة من دوديكان، هكساديكان، ثنائي-2-إثيل هكسيل فثالات-BEHP، ومركب بالعلامة التجارية Fluorinert® FC-70. ويمكن أن يتضمن المذيب اللاقطبي بشكل اختياري مادة خافضة للتوتر السطحي مثل دوديسيل كبريتات الصوديوم. وفي بعض تجسيدات الاختراع، يكون المنتج المعني الذي أساسه الكربون قابل للذوبان في الطور اللاقطبي. وفي تجسيدات أخرى للاختراع، يشتمل الطور اللاقطبي على المركب المعني الذي أساسه الكربون. وفي تجسيد آخر للاختراع، تشتمل المذيبات العضوية في الطور اللاقطبي مركبات هكسان، مركبات أوكتان، مركبات ديكان، و/أو مركبات دوديكان. وفي تجسيد آخر أيضاً، تشتمل مركبات الألكان على أي من أو كل من الأشكال الخطية أو المتفرعة. وفي تجسيد آخر أيضاً، يشتمل الطور اللاقطبي على هيدروكربون خطي ومتفرع. وفي أحد أوجه الاختراع، يشتمل الهيدروكربون على سلسلة بها من 6 إلى 30 جزيء كربوني. وفي تجسيد آخر أيضاً للاختراع، يختار الطور اللاقطبي بناء على درجة حرارة المستنبت ثنائي الطور لتقليل تبخير الطور اللاقطبي تحت ظروف الاستنبات. وفي تجسيد آخر، يختار الطور اللاقطبي بناء على مشاركته في استخلاص الجزيئات المعنية التي أساسها الكربون من خلية عائلة.
ويشير المصطلح "طور قطبي" كما استخدم هنا إلى طور مكون من جزيئات تظهر طبيعة أكثر ألفة نحو الماء مقارنة بطبيعة الطور اللاقطبي في محلول ثنائي الطور. وفي أحد تجسيدات الاختراع، يشتمل الطور القطبي على وسط مستنبت خلايا. وفي تجسيد آخر للاختراع، يشتمل الطور القطبي أيضاً على مركبات دكسترين حلقي.
ويُراد من المصطلح "خلية عائلة معدلة" (أو ببساطة "خلية عائلة")، كما استُخدم هنا، أنْ يشير إلى خلية تم إدخال ناقل مأشوب فيها. ويجدر فهم أنه يُراد من هذه المصطلحات ألا تشير إلى الخلية التابعة الخاصة فحسب بل إلى سلالة تلك الخلية. ونظراً إلى احتمالية حدوث تعديلات معينة في الأجيال المتعاقبة إما بسبب الطفرات أو الآثار البيئية، ربما لن تكون تلك السلالة، في الواقع، مطابقة للخلية الأمّ، لكن لا تزال ضمن نطاق مصطلح "الخلية العائلة المعدلة" المستخدم هنا. والخلية العائلة المأشوبة هي خلية معزولة أو نسل خلوي زرعت في مستنبت أو قد تكون خلية مستقرة في نسيج حيّ أو كائن حيّ دقيق. ويتضمن مصطلح "خلية عائلة" بدون تحديده التعريف المراد لمصطلح "خلية عائلة معدلة".
وكما استخدم هنا، فإن مصطلح "الجزيء" يعني أي مركب، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، جزيء صغير، ببتيد، بروتين، سكر، نكليوتيد، حمض نووي، شحم وغيرها ويمكن أن يكون هذا المركب طبيعي أو اصطناعي.
ويشير مصطلح "الكتلة الحيوية" إلى مادة حيوية ينتجها النظام الحيوي بما في ذلك مادة مفيدة كمصدر للطاقة المتجددة.
ويشير المصطلح "هيدروكربون" بوجه عام إلى مركب كيميائي مكون من عناصر كربون (C)، هيدروجين (H) وأكسجين بشكل اختياري (O). وهناك ثلاثة أنواع أساسية من الهيدروكربونات، مثل الهيدروكربونات العطرية، الهيدروكربونات المشبعة والهيدروكربونات غير المشبعة مثل مركبات الألكين، مركبات الألكاين، ومركبات الديين. ويتضمن المصطلح أيضاً وقود، وقود حيوي، بلاستيك، شموع، مذيبات وزيوت.
ويشير المصطلح "وقود حيوي" كما استخدم هنا إلى أي وقود يحصل عليه من مصدر حيوي. ويشير الوقود الحيوي إلى هيدروكربون واحد أو أكثر، كحول واحد أو أكثر، إستر دهني واحد أو أكثر أو مخاليط منها. وبشكل بديل، تستخدم الهيدروكربونات السائلة.
ويشير مصطلح "مكون الوقود" إلى أي مركب أو خليط من المركبات الذي يستخدم لتشكيل تركيب وقود. وهنالك "مكونات وقود رئيسية" و"مكونات وقود ثانوية". ويتواجد مكون الوقود الرئيسي في تركيب الوقود بنسبة تبلغ 50٪ حجماً على الأقل، بينما يتواجد مكون الوقود الثانوي في تركيب الوقود بنسبة تقل عن 50٪.وتعتبر المواد المضافة للوقود من مكونات الوقود الثانوية.
ويتضمن مصطلح "الإستر الدهني" أي إستر مكون من حمض دهني. وقد تحتوي السلاسل الكربونية في الأحماض الدهنية على أية توليفة من التعديلات الموصوفة هنا. فعلى سبيل المثال، يمكن أن تحتوي السلسلة الكربونية على موقع واحد أو أكثر من المواقع غير المشبعة، مواقع التفرع، بما في ذلك التفرع الحلقي، ويمكن توجيهها بحيث تصبح سلسلة طويلة أو قصيرة. ويمكن استخدام أي كحول لتشكيل إسترات الأحماض الدهنية، مثل مركبات الكحول التي تيم الحصول عليها من مسار التصنيع الحيوي للحمض الدهني، مركبات الكحول الناتجة عن طريق إنتاج العائل بواسطة مسارات تصنيع حيوي لحمض غير دهني، مركبات الكحول المزودة في تخمر المَرَق.
ويشير مصطلح "الحمض الدهني" إلى منتجات أو مشتقات منه مكونة جزئياً من خلال مسار التصنيع الحيوي للحمض الدهني في الكائن الحي الدقيق العائل. ويتضمن مسار التصنيع الحيوي للحمض الدهني إنزيمات سينثاز للحمض الدهني التي يمكن توجيهها كما وصف هنا لإنتاج مشتقات الحمض الدهني، وفي بعض الأمثلة يمكن التعبير عنه باستخدام إنزيمات إضافية لإنتاج مشتقات الحمض الدهني التي لها خصائص السلسلة الكربونية المرغوبة. وتتضمن مشتقات الحمض الدهني التمثيلية على سبيل المثال، مركبات كحول قصيرة وطويلة السلسلة، هيدروكربونات، وإسترات أحماض دهنية بما في ذلك الشموع.
ويشتمل المصطلح "منتجات معنية أساسها الكربون" كحولات مثل إيثانول، بروبانول، أيزوبروبانول، بيوتانول، أحماض دهنية، استرات أحماض دهنية، استرات شمعية؛ هيدروكربونات وألكانات مثل البروبان، الأوكتان، الديزل، مادة داسرة نفاثة 8 (JP8)؛ بوليمرات مثل ثيرفثالات، 1، 3-بروبان دايول، 1، 4-بيوتان دايول، متعددات هيدروكسيل، مركبات متعدد هيدروكسي ألكانوات (PHA)، متعدد بيتا هيدروكسي بيوتيرات (PHB)، أكريلات، حمض الأديبيك، إبسيلون-كبرولاكتون، أيزوبرين، كبرولاكتام، مطاط؛ سلع كيميائية مثل اللاكتات، حمض دوكوزاهكسائينويك (DHA)، 3-هيدروكسي بروبيونات، γ-فاليرو لاكتون، لايزين، سيرين، أسبارتات، حمض الأسبارتيك، سوربيتول، أسكوربات، حمض الأسكوربيك، أيزوبنتينول، لانوستيرول، أوميغا-3 DHA، ليكوبين، إيتاكونات، 1، 3- بيوتادايين، اثيلين، بروبيلين، سكسينات، سيترات، حمض الستريك، الغلوتامات، المالات، وحمض 3 – هيدروكسي بروبيونيك (HPA)، حمض اللاكتيك، THF، غاما بيوتيرو لاكتون، مركبات بيروليدين، هيدروكسي بيوتيرات، حمض الجلوتاميك، حمض الليفولينيك، حمض الاكريليك، وحمض المالونيك؛ مواد كيميائية خاصة مثل أشباه الكاروتين، أشباه أيزوبرين، حمض إيتاكونيك المستحضرات الصيدلانية والمركبات الوسيطة الصيدلانية مثل حمض 7- أمينو دياسيتوكسي سيفالوسبورانيك (7ADCA)/ سيفالوسبورين، اريثرومايسين، متعددات كيتيد، ستاتين، باكليتاكسيل، دوسيتاكسيل، مركبات تربين، ببتيد، ستيرويدات، الأحماض الدهنية أوميغا، أولفينات وألكينات وغيرها من المنتجات المناسبة المعنية. وهذه المنتجات تكون مفيدة في سياق الكلام عن الوقود، المواد الكيميائية الصناعية والخاصة، مثل مواد وسيطة تستخدم في صنع منتجات إضافية، مثل المكملات الغذائية، المستحضرات الغذائية، البوليمرات، بدائل البارافين، منتجات العناية الشخصية والمستحضرات الصيدلانية.
ويشير المصطلح "تقويضي" و"تقويض" كما استخدم هنا إلى عملية تحلل جزيء أو تفكك الجزيئات الكبيرة إلى جزيئات أصغر. ويشير "تقويضي" أو "تقويض" إلى مسار تفاعل معين حيث يحدث تحلل لجزيء بواسطة مكون حفزي واحد أو عدة مكونات حفزية أو عملية الخلية الكاملة العامة حيث يحدث تحلل لجزيء باستخدام أكثر من مسار تفاعل محدد وعدد كبير من المكونات الحفزية.
ويشير المصطلح "ابتنائي" و"ابتناء" كما استخدم هنا إلى عملية البناء الكيميائي للجزيئات الصغيرة إلى الجزيئات الكبيرة. ويشير ابتنائي إلى مسار تفاعل معين حيث يحدث بناء الجزيء بواسطة مكون حفزي واحد أو عدة مكونات حفزية أو عملية الخلية الكاملة العامة حيث يحدث بناء الجزيء باستخدام أكثر من مسار تفاعل محدد وعدد كبير من المكونات الحفزية.
ويشير المصطلح "داخلي المنشأ" كما هو مستخدم هنا عند الإشارة إلى جزيء الحمض النووي وخلية معينة أو كائن حي دقيق معين إلى تسلسل الحمض النووي أو الببتيد الموجود في الخلية ولم يتم إدخاله في الخلية (أو أسلافها) باستخدام تقنيات الهندسة المأشوبة. على سبيل المثال، الجينات التي كانت موجودة في الخلية عندما تم عزل الخلية أصلا من الطبيعة. ولا تزال تعتبر الجينات بأنها داخلية المنشأ إذا تم تعديل التسلسلات الضابطة، مثل التسلسلات المحضضة أو المعززة التي تنشط النسخ أو الترجمة من خلال تقنيات التأشب.
ويشير المصطلح "خارجي المنشأ" كما هو مستخدم هنا عند الإشارة إلى جزيء الحمض النووي وخلية معينة أو كائن حي دقيق معين إلى تسلسل الحمض النووي أو الببتيد غير الموجود في الخلية عندما تم عزل الخلية أصلا من الطبيعة. على سبيل المثال يكون الحمض النووي الذي أنتج في كائن حي دقيق مختلف وتم تعديله هندسياً إلى خلية بديلة باستخدام تقنيات الـ DNA المأشوب أو طرق أخرى لتحرير هذا الحمض النووي خارجي المنشأ.
ويشير المصطلح "إطلاق"، كما هو مستخدم هنا إلى حركة مركب من داخل الخلية (خلوي داخلي) إلى خارج الخلية (خلوي خارجي). ويمكن أن تكون الحركة فعالة أو غير فعالة. وعندما يكون الإطلاق فعالاً فإنه يمكن تسريعه بواسطة ببتيد ناقل واحد أو أكثر وفي بعض الأمثلة يمكن أن يستهلك الطاقة. وعندما يكون الإطلاق غير فعال، فإنه يمكن أن يحدث من خلال الانتشار عبر الغشاء، ويمكن تسريعه عن طريق الاستمرار بجمع المركب المرغوب من البيئة خارج الخلية، وبالتالي تشجيع المزيد من الانتشار. ويمكن أيضا إطلاق مركب عن طريق تحليل خلية. ويمكن أن تؤثر المركبات الخلوية الخارجية في الأوساط الخلوية على إطلاق مركب.
ويشير المصطلحان "قابل للامتزاج" أو "قابلية الامتزاج" إلى عدم القدرة النسبية للمركب على الذوبان في الماء وتُحدد بمعامل تقاسم المركبات. ويُعرَّف معامل التقاسم، P، بأنه التركيز عند الاتزان للمركب في الطور العضوي (يكون الطور العضوي في نظام ثنائي الطور عادة عبارة عن الطور المتكون من مشتقة الحمض الدهني أثناء عملية الانتاج غير أنه في بعض الأمثلة يمكن تزويد طور عضوي، مثل طبقة من الدوديكان لتسريع فصل المنتجات) مقسوماً على التركيز عند الاتزان في الطور المائي (أي مرق التخمير). وعند وصف نظام ثنائي الطور فإنه يتم وصف P عادة بدلالة logP. ويقسَّم المركب الذي له logP يساوي 10 بنسبة 1:10 في الطور العضوي بينما يقسَّم المركب الذي له logP يساوي 0.1 بنسبة 1:10 في الطور المائي.
ويشير مصطلح "ظروف التخمير المناسبة" عموما إلى أوساط التخمير والظروف القابلة للتعديل مثل، درجة الحموضة ودرجة الحرارة ومستويات التهوية، الخ، ويفضل الظروف المثلى التي تسمح للكائنات الحية الدقيقة بإنتاج المنتجات المعنية التي أساسها الكربون. ولتحديد فيما إذا كانت ظروف الاستنبات تسمح بإنتاج المنتج، فإنه يمكن استنبات الكائنات الحية الدقيقة لمدة حوالي 24 ساعة إلى أسبوع واحد بعد التلقيح، ويمكن الحصول على عينة وتحليلها. ويتم اختبار الخلايا في العينة أو الوسط الذي تم فيه زراعة الخلايا لتحديد وجود المنتج المرغوب.
وتوصف طرق ومواد نموذجية أدناه، على الرغم من أنه يمكن استخدام طرق ومواد مماثلة أو مساوية لتلك الموصوفة هنا أيضا عند تطبيق الاختراع، وسوف تكون واضحة لأولئك المتمرسين في التقنية. ولقد دمجت جميع النشرات وغيرها من المراجع المذكورة هنا للرجوع إليها في مجملها. وفي حالة التعارض، سيتم الرجوع إلى المواصفة الحالية متضمنة التعريفات. وتكون المواد والطرق والأمثلة توضيحية فقط وليس المقصود منها أن تكون محددة.
وخلال هذه المواصفة وعناصر الحماية، سيكون مفهوما أن كلمة "يشتمل" واشتقاقاتها تدل على تضمين العدد الصحيح المذكور أو المجموعة المذكورة من الأعداد الصحيحة ولكن ليس استبعاد أي عدد صحيح آخر أو مجموعة أخرى من الأعداد الصحيحة.